【摘要】：草魚出血病是一種由草魚呼腸孤病毒(grass carp hemorrhage virus,GCRV)引起的傳播能力強(qiáng)、致死率高嚴(yán)重危害草魚業(yè)發(fā)展的重要疾病。目前幾乎沒有治療草魚出血病的藥物,且長期用藥易導(dǎo)致水體污染、產(chǎn)生抗藥性等問題。疫苗免疫是一種預(yù)防草魚出血病較為可行的方案,但由于注射免疫操作繁瑣、易對(duì)魚體造成傷害、產(chǎn)生應(yīng)激,浸泡免疫效果差且易造成環(huán)境污染。因此,急需研發(fā)適于操作且免疫效果佳的解決方案。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一種公認(rèn)的食品級(jí)安全的微生物,以其為載體研制口服疫苗是乳酸菌應(yīng)用的新領(lǐng)域和新熱點(diǎn)。本研究通過克隆GCRV外殼蛋白VP7并將其連接、轉(zhuǎn)化至植物乳桿菌NC8中,制備乳桿菌介導(dǎo)的草魚出血病口服疫苗,進(jìn)而通過口服飼喂草魚進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià):試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)分組,1.0×10~9 CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)組、1.0×10~8CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)組、1.0×10~9 CFU/g空載體(pSIP409)組、1.0×10~8CFU/g空載體(pSIP409)組和空白對(duì)照(PBS)組,飼料投喂量按照體重的3%進(jìn)行投喂,每天投喂1次,連續(xù)投喂2天。兩周后按照同樣的方式加強(qiáng)免疫一次。免疫結(jié)束后的第1 d、3 d、7 d、12 d、16 d、21 d、31 d和38 d分別采集血液、肝、腎,利用ELISA法檢測血清中IgM抗體動(dòng)態(tài)水平;利用RT-PCR法測定口服免疫重組乳酸菌疫苗對(duì)草魚免疫相關(guān)基因IL-1β、IFN I、MHC-II B表達(dá)的影響;利用檢測試劑盒測定血清中溶菌酶及肝臟中POD、SOD的活性;取腸道組織,研究重組乳酸菌在草魚腸道內(nèi)的定植情況,取得結(jié)果如下:ELISA結(jié)果顯示:口服免疫(pSIP409-vp7)組血清中IgM的抗體水平均呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢且均顯著高于空載體(pSIP409)組和空白對(duì)照(PBS)組(P0.05),并于第12d時(shí)達(dá)到峰值(OD_(490):1.29;OD_(490):1.19)。同時(shí),1.0×10~9 CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)組的抗體水平高于1.0×10~8 CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)組。RT-PCR結(jié)果顯示:口服免疫乳酸菌疫苗后,兩個(gè)濃度組腎臟的免疫相關(guān)基因IL-1β、IFN I、MHC-II B表達(dá)量均呈現(xiàn)升高趨勢,其中口服免疫(pSIP409-vp7)組表達(dá)量顯著高于空載體(pSIP409)組和空白對(duì)照(PBS)組,且1.0×10~9 CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)組的表達(dá)量明顯高于其它組別(P0.05)。非特異性免疫指標(biāo)檢測結(jié)果顯示:口服乳酸菌重組疫苗可顯著提高草魚血液和肝臟中超氧化物歧化酶(SOD),過氧化物酶(POD)和溶菌酶(LZM)的活性,且其活性均顯著高于空白對(duì)照(PBS)組(P0.05)。兩個(gè)濃度組的口服免疫(pSIP409-vp7)組SOD、POD和LZM活性在7-12 d達(dá)到峰值。腸道定植試驗(yàn)結(jié)果表明,重組乳酸菌主要定植在草魚腸道后端,其定植時(shí)間為7-12d。上述結(jié)果表明重組乳酸菌疫苗可顯著提高草魚IgM的抗體水平以及非特異性免疫指標(biāo)水平,并可促進(jìn)免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平,進(jìn)而提升草魚的免疫反應(yīng)水平,結(jié)果可為其他水產(chǎn)動(dòng)物相關(guān)病毒的防治提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S943
【圖文】：

圖 1.2 pSIP409- vp7 重組質(zhì)粒提取結(jié)0 DNAMarker； 1、2、3： pSIP409.2 pSIP409-vp7 recombinant plasmid exNAMarker; 1, 2, 3: pSIP409-vp7 plasm409-vp7 的 PCR 擴(kuò)增與酶切鑒定9-vp7 為模板，進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證和片段大小和雙酶切條帶大小與預(yù)p 大小的目的條帶；雙酶切檢測1 bp 大小的條帶。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)段序列完全一致。經(jīng)上述結(jié)果可判 1.3、1.4。

PCR鑒定M：DL10000DNAMarker；1：PCR產(chǎn)物

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本文編號(hào)：2724012