【摘要】：包括白細胞介素(Interleukin)和干擾素(Interferon)在內(nèi)的細胞因子(cytokines)具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應性免疫等多種功能。眾多細胞因子在生物體內(nèi)通過多種分泌方式如旁分泌、自分泌等發(fā)揮作用,形成了極為復雜的細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡,參與生物體各種重要的生理功能。魚類作為最低等的脊椎動物,既具有固有免疫同時也具有適應性免疫,是免疫進化研究中極為重要的研究對象。本文以模式動物斑馬魚為研究對象,通過生物信息學分析獲得了一個魚類中特異存在的新型細胞因子,該細胞因子在基因結構上與斑馬魚白細胞介素或干擾素存在相似性,且與斑馬魚白細胞介素22、白細胞介素26、伽馬干擾素I及其受體相鄰位于斑馬魚4號染色體上,所以我們暫將其命名為FIL(Fish-specific Interleukin/Interferon like molecule)。為進一步探究該新型細胞因子的功能,我們首先通過RACE技術獲得FIL基因全長1243bp,其中包括CDS區(qū)639bp,隨后通過熒光定量PCR檢測FIL在健康斑馬魚各組織中的表達情況,結果顯示FIL在健康斑馬魚的后腸、鰓、皮膚等粘膜組織中表達量較高。接著我們分別用POLY I:C、遲緩型愛德華氏菌(Edwardsiella tarda,Et)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)三種刺激物腹腔注射感染斑馬魚,經(jīng)熒光定量PCR檢測,結果顯示,FIL在斑馬魚經(jīng)病毒及其類似物感染后,在脾臟中迅速表達,在腸中表達量較低。在細菌感染后,FIL主要在粘膜組織中發(fā)揮免疫作用。為進一步探究FIL的生物學功能,我們構建得到FIL的原核重組質(zhì)粒和真核重組質(zhì)粒,且成功表達純化獲得原核、真核重組蛋白。同時我們制備了斑馬魚FIL的多克隆抗體,經(jīng)Western blot檢測表明該多克隆抗體可特異性識別FIL重組蛋白。隨后我們將純化后的原核表達蛋白按照不同梯度刺激斑馬魚ZF4細胞系,以了解在細胞水平上FIL蛋白的生物活性及生物學功能。將刺激后細胞進行轉錄組測錄,結果顯示FIL在斑馬魚抗病毒免疫及炎癥反應中發(fā)揮作用。我們選取相應靶標基因進行熒光定量PCR驗證,進一步印證了轉錄組所得結果。緊接著,我們希望通過解析FIL分子晶體結構的方式進一步鑒定其分類學地位。我們對純化所得的高純度原核蛋白進行結晶,獲得了質(zhì)量較高的蛋白晶體,并對該晶體進行光學衍射,收集到了該晶體的結構數(shù)據(jù),但通過與蛋白結構數(shù)據(jù)庫中的其他蛋白序列進行對比,我們發(fā)現(xiàn)盡管斑馬魚FIL基因在氨基酸序列上與白細胞介素及干擾素相似度較高,但在蛋白結構預測上與二者同源性較低。因此我們需要獲得FIL蛋白的硒代衍生物并獲得其晶體,進一步進行衍射,硒代蛋白結晶的條件摸索工作在本文中得以體現(xiàn),結晶衍射數(shù)據(jù)待獲得。通過本實驗一系列工作,我們對斑馬魚新型細胞因子FIL的生物化學功能、基因結構及蛋白構象有了進一步的鑒定,為該細胞因子的后續(xù)研究奠定基礎。S100家族蛋白是一組小的酸性多肽,在調(diào)節(jié)生理過程的許多方面具有多種功能。它們結構保守,具有兩個EF-指針,對于鈣介導的功能十分重要。已知S100家族蛋白參與宿主防御,例如調(diào)節(jié)鈣止血和細胞遷移。盡管已經(jīng)在硬骨魚中描述了S100家族基因,但它們在免疫防御中的作用研究很少。我們在斑馬魚中測定了13個S100的cDNA序列,并確認了它們所在的基因組。重新分析S100基因座的基因同源性揭示了Chr16和Chr19中存在兩個主要S100基因座,其中包含13個串聯(lián)連接的S100基因的染色體被認為與人Chr1中的S100基因座共享共同起源。可以推測兩個S100斑馬魚基因座在硬骨魚特異性全基因組復制事件期間從單個基因座進化而來。似乎人類S100G和S100P的同源物已經(jīng)在斑馬魚中丟失了。S100基因在中樞(頭腎和脾臟)和粘膜(鰓和后腸)免疫器官中檢查組成型表達,在粘膜組織中相對高表達。腹膜內(nèi)注射poly(I:C)導致腸道中大多數(shù)S100基因的上調(diào),特別是誘導S100V2和S100Z的表達顯著升高,注射后48小時的脾臟表達也顯著升高。在用鯉春病毒血癥病毒(SVCV)刺激斑馬魚的實驗中,在感染后第1天和第7天之間脾臟中大多數(shù)S100基因的表達增加,觀察到S100A10a,S100A10b,S100A10ICN1,S100A10U,S100V1和S100Z的一致誘導。腹腔注射E.tarda可下調(diào)腸道中S100基因的表達,但在注射后72小時脾臟中的S100基因上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn),魚類S100基因與哺乳動物對應物有共同的起源。斑馬魚S100基因受細菌和病毒病原體的差異調(diào)節(jié),參與魚類的免疫防御。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

采用隱馬爾科夫模型對FIL信號肽序列的預測

圖 2-2：采用神經(jīng)網(wǎng)絡模型對 FIL 信號肽序列的預測.2 斑馬魚 FIL 蛋白同源性及結構域比對通過 NCBI 進行全基因序列比對，斑馬魚 FIL 位于第 4 號染色體上，位于

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 王俊相;李玉萍;孔令富;李蓮軍;;魚類免疫系統(tǒng)的研究進展[J];四川畜牧獸醫(yī);2010年07期

2 尹湘艷;胡國斌;張建業(yè);劉秋明;;魚類干擾素系統(tǒng)的研究進展[J];生命科學儀器;2009年09期

本文編號：2723114