【摘要】：補體系統(tǒng)是先天免疫的重要組成部分和免疫效應(yīng)系統(tǒng),在無脊椎動物免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前,對甲殼動物特別是蟹類補體系統(tǒng)的研究尚處于起步階段,亟待深入研究。本論文利用基因克隆、實時定量PCR、原核重組表達、RNA干擾等分子生物學(xué)技術(shù),對三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的C1q受體(PtgC1qR)、α2-巨球蛋白(PtA2M-1和PtA2M-2)、含硫酯蛋白(PtTEP)和甘露糖結(jié)合凝集素(PtMBL)等補體樣分子進行了結(jié)構(gòu)和免疫功能的研究,探討了補體樣分子之間的作用關(guān)系以及它們在三疣梭子蟹免疫系統(tǒng)中的作用。補體C1q受體gC1qR是一種多功能、多配體的結(jié)合蛋白。三疣梭子蟹的PtgC1qR編碼含有268個氨基酸殘基的蛋白,該預(yù)測的蛋白含有1個保守的MAM33結(jié)構(gòu)域,且其前56個氨基酸為線粒體靶序列。PtgC1qR基因在所有檢測的組織中均有表達,且在肝胰腺中表達豐度最高。PtgC1qR在受精卵和卵裂期的表達水平顯著高于囊胚期、原腸期和心跳期,暗示PtgC1qR可能是一種母源免疫基因。病原微生物刺激后,PtgC1qR在血細胞中的表達呈現(xiàn)時間依賴性響應(yīng)模式。此外,PtgC1qR重組蛋白(rPtgC1qR)可與革蘭氏陽性菌(藤黃微球菌Micrococcus luteus、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)和革蘭氏陰性菌(溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa)緊密結(jié)合,并顯著抑制其生長,暗示PtgC1qR在三疣梭子蟹免疫防御和免疫識別中扮演重要角色;然而rPtgC1qR對真菌(畢赤酵母菌Pichia pastoris)的結(jié)合活力較弱且未表現(xiàn)出抑菌活力。酚氧化酶實驗結(jié)果表明,rPtgC1qR可在體外以劑量依賴方式抑制酚氧化酶活力,且在蛋白濃度為11.65μM時幾乎100%抑制酚氧化酶活力。RNAi結(jié)果表明,沉默PtgC1qR基因后,絲氨酸蛋白酶相關(guān)基因(PtcSP1-3、PtSPH),酚氧化酶原激活相關(guān)基因(PtproPO、PtPPAF)和C3樣基因(PtA2M-1and PtTEP)的表達顯著升高;然而吞噬作用相關(guān)基因(PtMyosin、PtRab5和PtArp)和PtA2M-2的表達量顯著降低。α2-巨球蛋白(alpha-2 macroglobulin,A2M)是一種廣泛存在的蛋白酶抑制劑。本研究克隆獲得2條A2M基因,分別命名為PtA2M-1和PtA2M-2。PtA2M-1和PtA2M-2蛋白分別含有1,541和1,516個氨基酸,均包含A2M典型的結(jié)構(gòu)域。節(jié)肢動物的A2M主要在血細胞中高表達,PtA2M-1和PtA2M-2在鰓、眼柄和消化道中表達量較高,而它們在血細胞中表達量很低。在胚胎發(fā)育過程中,PtA2Ms在受精卵中表達量最高,暗示它們可能是母源基因。感染溶藻弧菌后,PtA2M-1和PtA2M-2呈相似的時間依賴性響應(yīng)模式。與PtA2M-2基因相比,PtA2M-1對藤黃微球菌和畢赤酵母菌的刺激更為敏感。沉默PtA2M-1或PtA2M-2基因可顯著增強酚氧化酶原激活相關(guān)基因(PtproPO和PtPPAF)和絲氨酸蛋白酶相關(guān)基因(PtcSP1-3和PtSPH)的表達,然而PtLSZ和吞噬作用相關(guān)基因(PtMyosin和PtRab5)表達顯著被抑制。PtA2M-1或PtA2M-2基因沉默的三疣梭子蟹血淋巴中酚氧化酶和溶菌酶活力變化也支撐上述結(jié)果。此外,研究發(fā)現(xiàn)PtA2Ms可能通過Toll和NF-kB通路調(diào)控抗菌肽基因(PtALF1-3、PtCrustin1和PtCrustin3)的表達。含硫酯蛋白(thioester-containing proteins,TEPs)是一類在進化上古老的分泌型效應(yīng)蛋白。三疣梭子蟹PtTEP的開放閱讀框為4,434 bp,編碼一個含有1,478個氨基酸殘基的多肽,該肽鏈具有昆蟲TEP蛋白保守的序列特征。PtTEP在肝胰腺、腸、鰓等主要免疫組織中高表達,在受到細菌或真菌誘導(dǎo)后表達量顯著升高。與受精卵時期相比,PtTEP的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物呈先下降后顯著升高的變化趨勢。利用RNA干擾技術(shù)沉默PtTEP基因后,酚氧化酶原激活相關(guān)基因(PtproPO和PtPPAF)和絲氨酸蛋白酶相關(guān)基因(PtcSP1-3和PtSPH)均顯著上調(diào),而PtLSZ和吞噬作用相關(guān)基因(PtMyosin和PtRab5)的表達顯著受到抑制。PtTEP基因沉默的三疣梭子蟹血淋巴酚氧化酶和溶菌酶活力的變化也支持上述結(jié)果。此外,PtTEP基因沉默后抗菌肽基因和參與Toll和NF-κB通路激活的基因表達量均顯著下降,這使得三疣梭子蟹更容易感染溶藻弧菌而死亡。甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)作為一種重要的模式識別受體,參與補體凝集素途徑的激活。本研究自三疣梭子蟹中克隆獲得一個新型MBL分子(PtMBL)。PtMBL的cDNA全長為994 bp,包含一個777-bp的ORF,可編碼含有259個氨基酸殘基的蛋白,該蛋白具有保守的糖識別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-recognition domain,CRD),在CRD區(qū)域中含有一個QPD序列。PtMBL在肌肉、腸、胃和肝胰腺等主要免疫組織中高表達,且PtMBL的mRNAs在感染細菌或真菌的早期均顯著上調(diào)。隨著胚胎的發(fā)育,PtMBL的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物呈現(xiàn)顯著下降趨勢,并在發(fā)育至心跳期時達到最低值,結(jié)合該基因在卵巢中顯著高表達,提示PtMBL是一種母源免疫因子。沉默PtMBL基因可顯著提高PtTEP、酚氧化酶原激活相關(guān)基因(PtproPO和PtPPAF)和絲氨酸蛋白酶相關(guān)基因(PtcSP1-3和PtSPH)的表達,然而PtA2Ms和吞噬作用相關(guān)基因(PtArp、PtMyosin和PtRab5)的表達顯著被抑制。與對照組相比,PtMBL基因沉默的三疣梭子蟹血淋巴中PO活力顯著升高。此外,沉默PtMBL基因,抗菌肽基因和參與Toll和NF-κB通路激活的關(guān)鍵基因的表達均顯著上調(diào)。對三疣梭子蟹補體樣分子的研究表明,它們與脊椎動物補體分子在結(jié)構(gòu)上和免疫功能上均存在較高的相似性。研究認為,PtgC1qR和PtMBL作為模式識別受體,可通過調(diào)控下游C3樣分子(PtA2M-1、PtA2M-2和PtTEP)激活原始的補體通路,三疣梭子蟹中原始的補體通路可通過調(diào)控絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)、酚氧化酶原激活系統(tǒng)、吞噬作用以及Toll和NF-κB免疫通路介導(dǎo)的抗菌肽合成與分泌執(zhí)行其免疫功能。同時,補體樣分子也可以作為母源性效應(yīng)分子參與對病原的免疫防御反應(yīng)。綜上,本研究結(jié)果表明補體樣分子在三疣梭子蟹的先天免疫防御中具有重要作用,為進一步闡明無脊椎動物補體系統(tǒng)的進化以及系統(tǒng)地研究原始補體系統(tǒng)的功能提供了新思路和理論支撐。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

三疣梭子蟹補體樣分子結(jié)構(gòu)及免疫功能研究吞噬作用是多細胞動物中最古老、最基本地抵御病原入侵的防衛(wèi)機制之一。甲殼動物的成熟血細胞可將自身壞死細胞、細胞碎片以及異源微生物吞入胞內(nèi)，隨后利用胞內(nèi)的活性氧、溶酶體的酸性或堿性磷酸酶等將這些非己物質(zhì)溶解、消化和清除。當病原或異物顆粒較大，單個血細胞無法吞入時，甲殼動物便采取多細胞協(xié)作防御機制，也就是包被作用。在包被作用過程中，顆粒細胞和半顆粒細胞釋放顆粒后與周圍細胞相互連接形成包囊（Wertheim 等., 2005）。包被過程經(jīng)常伴有絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中間物和黑色素的毒性作用，這便形成了消滅和清除入侵病原的綜合防御機制（Dubovskiy 等., 2008）。然而，當入侵的病原數(shù)目過多時，甲殼動物血細胞內(nèi)的黏附蛋白或整合素，可快速、有效地將固定病原形成結(jié)節(jié)，防止其進一步擴散，隨后通過酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)使結(jié)節(jié)發(fā)生黑化作用，從而大規(guī)模殺滅病原微生物。

圖 1.2 果蠅中由 PRRs 介導(dǎo)的免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Lemaitre 和 Hoffmann, 2007）Figure 1.2 PRRs mediated signal transduction pathways in Drosophila病原體的清除甲殼動物主要通過體液免疫和細胞免疫清除入侵的病原微生物，在其免程中，細胞免疫和體液免疫相互配合、相輔相成。例如甲殼動物的血細與細胞免疫，又能通過分泌各種免疫因子參與體液免疫，而體液免疫中些免疫因子又能促進細胞免疫效應(yīng)（Kim 和 Kim, 2005）。除此之外，的補體成分在血細胞中合成后分泌到血淋巴中參與體液免疫，在體液免進一步促進血細胞對病原微生物的吞噬作用（Song 等., 2000）。 節(jié) 補體系統(tǒng)椎動物的補體系統(tǒng)

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