【摘要】：大黃魚(Larimichthys crocea),屬于硬骨魚綱鱸形目,是我國傳統(tǒng)的“四大海產(chǎn)”之一。隨著大黃魚人工養(yǎng)殖日益興起,高密度、集約化養(yǎng)殖模式加速了魚體微生物病癥的發(fā)生,出現(xiàn)了如魚體生長衰退、抗病能力弱、品質(zhì)低等問題,嚴(yán)重影響并制約了大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。鰻弧菌是養(yǎng)殖大黃魚出現(xiàn)弧菌病的主要病原菌之一,而溶菌酶是魚體內(nèi)殺菌的關(guān)鍵酶,本文以大黃魚為研究對象,研究溶菌酶在大黃魚不同組織表達(dá)情況,并通過鰻弧菌侵染和ploy(I:C)處理,研究溶菌酶基因的脅迫反應(yīng),希望可以為以后大黃魚的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供一定的理論支持。主要結(jié)論如下:通過大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫獲得大黃魚兩種溶菌酶CDNA全長序列,并通過克隆測序進(jìn)行驗(yàn)證,c型溶菌酶CDNA全長為763bp,編碼110個(gè)氨基酸,其基因組數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)為XM-010753143.1;g型溶菌酶CDNA全長為879bp,編碼193個(gè)氨基酸,其基因組數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)為XM-010740410.1。魚類c型溶菌酶與哺乳動(dòng)物的親緣關(guān)系較近,魚類g型溶菌酶同鳥類親緣關(guān)系較近。研究兩種溶菌酶基因在大黃魚脾臟、腎臟、肝臟、心臟、肌肉、鰓、腸、腦這8種組織表達(dá)特異性情況,表明c型溶菌酶在肝臟中的表達(dá)量最高,在心和腸中的表達(dá)量略高于其他組織;g型溶菌酶在腸和腎表達(dá)量最高,其次是腮和肝、脾。鰻弧菌侵染實(shí)驗(yàn)證明:在肝臟、脾臟、腎臟組織中,c型溶菌酶的表達(dá)量比對照組低,但鰻弧菌侵染6h后,腎臟中c型溶菌酶表達(dá)顯著升高;g型溶菌酶的表達(dá)量呈先升高后降低趨勢,在肝臟中,鰻弧菌處理下g型溶菌酶在12h表達(dá)量達(dá)到峰值;ploy(I:C)處理下在24h表達(dá)量達(dá)到峰值。在脾臟中實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量在36h達(dá)到峰值;在腎臟中,鰻弧菌和ploy(I:C)處理下g型溶菌酶分別在36h和48h表達(dá)量達(dá)到峰值。本文通過對大黃魚兩種溶菌酶基因的全長序列的生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)以及鰻弧菌侵染對上述兩種溶菌酶基因表達(dá)量的影響這三方面的研究得出:1、c型和g型溶菌酶基因的保守性較高;2、健康大黃魚中兩種基因都在腸的表達(dá)量高,但效果不同;3、受到細(xì)菌侵染后肝臟、腎臟、脾臟中c型溶菌酶基因表達(dá)量變化不大,推測該溶菌酶可能主要發(fā)揮消化作用;g型溶菌酶基因在肝臟、腎臟、脾臟中表達(dá)量都有顯著上調(diào),只是最高表達(dá)量出現(xiàn)時(shí)間不同,說明g型溶菌酶參與了大黃魚的機(jī)體免疫。
【圖文】：

的氨基酸序列，它的網(wǎng)址為 http://ww件預(yù)測目的基因序列的等電點(diǎn)(pI)以及分rg/tools/protparam.html；使用 UCSC 在線進(jìn)行搜索，它的在線網(wǎng)址為 http://geno酶 ORF 獲得及序列分析結(jié)果據(jù)庫中查到溶菌酶全長基因序列，通過序列，并進(jìn)一步測序，通過同源性比對，閱讀框序列全長。實(shí)驗(yàn)所用模板取自于腦條大黃魚腦組織中總 RNA 提取的電泳

2.4.1.2 大黃魚 c 型溶菌酶基因 ORF 的獲得在大黃魚全基因組數(shù)據(jù)庫中獲得 c 型溶菌酶序列全長，在 NCBI 上通過同源性比對發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白與其他魚類的溶菌酶序列具有相似的長度，其編碼的蛋白也具有相同的保守結(jié)構(gòu)域。以此序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并測序，測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中一致。此基因在 GenBank 數(shù)據(jù)庫的登錄號(hào)為 XM-010753143.1。利用 ORFFinder 在線軟件對其開放閱讀框進(jìn)行搜索，獲得的 c 型溶菌酶基因 CDNA 序列全長為 763bp，5’非編碼區(qū) 143 bp，3’非編碼區(qū)長度為 287 bp，開放閱讀框長度為 333 bp，可編碼 110 個(gè)氨基酸。在線預(yù)測的 c 型溶菌酶多肽的相對分子質(zhì)量(MW)約為27.68kDa，理論等電點(diǎn)(pI )為 5.24。開放閱讀框具有八個(gè)保守的 Cys(半胱氨酸)，可形成 Cys4-Cys108，Cys12-Cys96，Cys46-Cys61，Cys57-Cys92 共四對二硫鍵。大黃魚 c型溶菌酶有 2 個(gè)保守的催化殘基位點(diǎn) Glu(E17)和 Asp(D34)。
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2711580