【摘要】：WT1(Wilms’tumor suppressor gene 1)是一種編碼鋅指蛋白的轉(zhuǎn)錄因子,對哺乳動物泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育有重要作用,哺乳類WT1基因突變會導(dǎo)致腎、性腺和脾等器官缺陷。在斑馬魚(Danio rerio)中存在兩個(gè)WT1同源基因,分別命名為wt1a和wt1b。本實(shí)驗(yàn)采用CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚中分別敲除wt1a和wt1b來研究其對斑馬魚胚胎發(fā)育的作用。純合的wt1a~(-/-)突變體后代表現(xiàn)出生長發(fā)育畸形,出現(xiàn)心包積液、卵黃囊水腫同時(shí)腎小球的發(fā)育也會受損;純合的wt1b~(-/-)突變體表型正常、能正常存活,沒有觀察到類似于敲降wt1b時(shí)所出現(xiàn)的表型。足細(xì)胞是機(jī)體形成腎小球?yàn)V過屏障的重要部分,其缺失能引發(fā)多種腎臟相關(guān)的疾病。為進(jìn)一步驗(yàn)證wt1a~(-/-)突變體發(fā)育畸形是否與腎臟足細(xì)胞發(fā)育相關(guān),我們選取了足細(xì)胞標(biāo)記基因podocin和nephrin,通過二者的表達(dá)量變化可知wt1a的缺失會阻斷足細(xì)胞的分化并抑制podocin和nephrin的表達(dá)。然而podocin和nephrin在wt1b~(-/-)突變體中能正常表達(dá)。因此,wt1a在斑馬魚腎臟發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用而wt1b可能不是腎臟發(fā)育所必須的基因。細(xì)胞自噬(autophagy)是真核細(xì)胞中一種普遍而又重要的生命現(xiàn)象,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生命活動等方面起重要作用,自噬異常與細(xì)胞生長發(fā)育及多種疾病密切相關(guān)。檢測發(fā)現(xiàn)在wt1a~(-/-)突變體中自噬水平明顯降低,為進(jìn)一步研究自噬、wt1a在足細(xì)胞發(fā)育中的功能,我們選取自噬激活藥物雷帕霉素處理斑馬魚胚胎一段時(shí)間后檢測足細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞的損傷得到了部分改善。綜上所述,我們的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了wt1a是斑馬魚腎臟發(fā)育所必須的基因,并且為建立魚類足細(xì)胞損傷的研究模型提供了一條思路。
【圖文】：

遠(yuǎn)端早期（distal early, DE）和遠(yuǎn)端晚期（distal late, DL）、腎小球（glomerulus, G）、頸部（neck, N）、斯坦尼氏小體（corpuscle of Stannius, CS）和前腎導(dǎo)管（pronephricduct,PD）。每個(gè)節(jié)段都能表達(dá)特定相關(guān)的基因，通過這些 maker 基因可對不同節(jié)段進(jìn)行區(qū)分。隨著機(jī)體發(fā)育至 48hpf，各個(gè)節(jié)段的腎管隨著機(jī)體細(xì)胞遷移完成前腎組織形態(tài)的發(fā)育，兩側(cè)的腎小球彼此靠攏并在尾部泄殖腔處融合，啟動血液濾過，形成有功能的前腎（Wingert et al 2007; Wingert and Davidson 2008）。隨著斑馬魚從胚胎到幼魚的蛻變，大約 10dpf 開始投喂，這一發(fā)育過程中伴隨著鱗和鰭的產(chǎn)生，臟器、神經(jīng)系統(tǒng)的重塑（Parichy et al 2009）。大約是為適應(yīng)更高的滲透壓環(huán)境斑馬魚的中腎腎單位在受精后 12-14dpf 開始形成，早期中腎的發(fā)生包括在尾部的腎祖細(xì)胞的初現(xiàn)，這些細(xì)胞聚集成簇，，上皮細(xì)胞變成腎小泡狀體，延伸至新的腎單位并與之融合，促進(jìn)中腎形成，而前腎隨之在 30-60dpf 退化（Zhou et al 2010; Diep et al 2011;Diep et al 2015）。中腎發(fā)育成熟后隨著機(jī)體的不斷發(fā)育會伴隨著新的腎單位產(chǎn)生以適應(yīng)體重變化和損傷修復(fù)的需要（Zhou et al 2010）。

圖 3-1 斑馬魚成魚各組織 RNA 的提取結(jié)果 The results of RNA extraction from various tissues of zlot 檢測 wt1a 和 wt1b 在各組織中的表達(dá)鼠的 WT1 抗體（Anti-Wilms Tumor Protein ant在斑馬魚各組織中的表達(dá)情況，選用 β-actin 作為 45KD。由圖 3-2 可知 WT1 主要在斑馬魚的
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2711065