【摘要】：中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma eriocheiris)是一種新型水生動(dòng)物病原,不僅是河蟹“顫抖病”的致病菌,也是引起克氏原螯蝦、南美白對(duì)蝦、羅氏沼蝦和日本沼蝦等水生甲殼動(dòng)物重大疫病的致病菌,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失,引起了國(guó)內(nèi)外同行的廣泛關(guān)注和重視,而建立有效的疫病檢測(cè)技術(shù),對(duì)疫情的快速診斷和鑒定,盡快明確病原,開(kāi)展有針對(duì)性的防治具有十分重要意義。本人所在課題組前期開(kāi)展了水生動(dòng)物螺原體的系列化研究,其中已經(jīng)建立光鏡、電鏡、PCR、ELISA、培養(yǎng)等檢測(cè)技術(shù),然而這些技術(shù)(除ELISA外)都需要相關(guān)的儀器、設(shè)備和技術(shù),無(wú)法在用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而前期建立的ELISA快速檢測(cè)技術(shù),雖然可以用于生產(chǎn)實(shí)際的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),但由于操作步驟較多,檢測(cè)花費(fèi)需要3小時(shí),操作者還需要進(jìn)行培訓(xùn)。因此,本碩士學(xué)位論文在前期研究的基礎(chǔ)上,開(kāi)展膠體金免疫層析檢測(cè)方法的研究,為中華絨螯蟹螺原體的檢測(cè)提供一種快速、簡(jiǎn)便和適應(yīng)性廣的方法,方便廣大養(yǎng)殖戶。本論文的研究結(jié)果主要包括以下2個(gè)方面:1、蝦蟹螺原體多克隆抗體的制備本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用常規(guī)多抗制備方法制備多抗,四次免疫后一周取血的方案,摸索出制備該病原高效價(jià)多抗的最佳制備方法,利用傳統(tǒng)間接ELISA方法進(jìn)行效價(jià)檢測(cè),4倍梯度稀釋到1:2097152,二抗稀釋比例為按1:3000。而且還通過(guò)親和力測(cè)定方法和使用sigmaplot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)模擬,得出親和力常數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所制備的螺原體多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1:32768,并且純化效果好、親和力常數(shù)為4×108,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都說(shuō)明,本研究制備的抗體可以作為下一步實(shí)驗(yàn)的材料。2、蝦蟹螺原體膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)的研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,以中華絨螯蟹螺原體多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記,利用雙抗體夾心膠體金免疫層析法,以中華絨螯蟹螺原體多克隆抗體作為檢測(cè)線捕獲抗體,以羊抗兔二抗為質(zhì)控線捕獲抗體,初步建立了能檢測(cè)中華絨螯蟹螺原體的膠體金試紙條。結(jié)果表明,制備的膠體金是40nm,最大吸收峰是522nm,用螺原體多抗標(biāo)記的最佳pH是8,最佳標(biāo)記濃度是15 μg/ml。選用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)作為反應(yīng)線多抗和羊抗兔IgG的稀釋液,用于實(shí)驗(yàn)包被硝酸纖維素膜,所研制的膠體金試紙條敏感性為104CCU/ml,特異性高。該方法操作簡(jiǎn)便,敏感性高和特異性強(qiáng),可用于現(xiàn)場(chǎng)大量樣品的檢測(cè)。
【圖文】：

以螺原體蛋ＦＩ作為抗原免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，第四次免疫后收集抗逡逑血清，采用間接ＥＬＩＳＡ法檢測(cè)抗血清的效價(jià)。采用倍比稀釋法進(jìn)行抗血清的測(cè)逡逑定，當(dāng)所測(cè)樣品的ＯＤ值與對(duì)照的比值大于２時(shí)，被判定為陽(yáng)性。如圖２．１所逡逑示，，此抗血清的效價(jià)在丨：３２７６８左右。逡逑通過(guò)肉眼觀察酶標(biāo)板上的顯色情況可以看出隨著稀釋倍數(shù)的增加，顏色明顯逡逑呈現(xiàn)梯度變化（圖２．１），且ＯＤ４５０值隨著稀釋倍數(shù)的增加呈現(xiàn)出顯著的遞減趨勢(shì)逡逑（表２．１）；而免疫前的健康兔血清（陰性對(duì)照）和空白對(duì)照則沒(méi)有相應(yīng)的梯度反逡逑應(yīng)，說(shuō)明通過(guò)免疫后得到的血清里確實(shí)含有了該抗原對(duì)應(yīng)的抗體，而且已成功制逡逑備出多克隆抗體。逡逑ｍｍ逡逑ｍ逡逑圖２．１免疫血清效價(jià)檢測(cè)逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｉｔｅｒ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ａｎｔｉｓｅｒａ逡逑注：陰性對(duì)照和空白對(duì)照各有３個(gè)孔如照片所示，其他為倍比稀釋抗血清，每個(gè)稀逡逑釋度均為３個(gè)孔逡逑１６逡逑

以螺原體蛋ＦＩ作為抗原免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，第四次免疫后收集抗逡逑血清，采用間接ＥＬＩＳＡ法檢測(cè)抗血清的效價(jià)。采用倍比稀釋法進(jìn)行抗血清的測(cè)逡逑定，當(dāng)所測(cè)樣品的ＯＤ值與對(duì)照的比值大于２時(shí)，被判定為陽(yáng)性。如圖２．１所逡逑示，此抗血清的效價(jià)在丨：３２７６８左右。逡逑通過(guò)肉眼觀察酶標(biāo)板上的顯色情況可以看出隨著稀釋倍數(shù)的增加，顏色明顯逡逑呈現(xiàn)梯度變化（圖２．１），且ＯＤ４５０值隨著稀釋倍數(shù)的增加呈現(xiàn)出顯著的遞減趨勢(shì)逡逑（表２．１）；而免疫前的健康兔血清（陰性對(duì)照）和空白對(duì)照則沒(méi)有相應(yīng)的梯度反逡逑應(yīng)，說(shuō)明通過(guò)免疫后得到的血清里確實(shí)含有了該抗原對(duì)應(yīng)的抗體，而且已成功制逡逑備出多克隆抗體。逡逑ｍｍ逡逑ｍ逡逑圖２．１免疫血清效價(jià)檢測(cè)逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｉｔｅｒ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ａｎｔｉｓｅｒａ逡逑注：陰性對(duì)照和空白對(duì)照各有３個(gè)孔如照片所示，其他為倍比稀釋抗血清，每個(gè)稀逡逑釋度均為３個(gè)孔逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S945

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2709659