【摘要】：翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)隸屬鱸形目(Perciformes)、鱖亞科(Sinipercinae)、鱖屬(Siniperca),是我國淡水優(yōu)質(zhì)魚類。至2014年,全國鱖魚產(chǎn)量已達293 853噸,廣東、江西、安徽等地區(qū)是主要養(yǎng)殖省份。養(yǎng)殖密度的增加導致水體生態(tài)環(huán)境惡化;長期人工繁殖忽視親本選育,導致鱖魚種質(zhì)退化,出現(xiàn)生長速度下降及抗病力降低的問題。因此,選育生長快的品種對鱖魚養(yǎng)殖至關(guān)重要。體重是衡量魚體生長發(fā)育的重要指標之一。骨骼肌占活魚體重的30%~80%,是魚體的主要組成部分,也是研究魚類生長的重要材料。大多數(shù)魚類在出生后通過肌纖維的不斷增生和肥大兩個過程進行肌肉生長,肌肉的生長發(fā)育過程被生長因子、調(diào)控蛋白、miRNA、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路、Wnt/β-catenin信號通路等多水平精確調(diào)控。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性、長度約22 nt非編碼小RNA,主要通過種子序列與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合調(diào)控基因的表達水平從而參與生物體的生長與發(fā)育、疾病等多種生理過程。在本研究中,我們以生長存在顯著差異的慢長組、快長組翹嘴鱖肌肉為材料,采用Illumina HiSeq深度測序技術(shù)、生物信息學及實驗方法,初步篩選與生長發(fā)育相關(guān)的miRNA,以期為鱖魚分子選育種提供候選基因。主要研究內(nèi)容如下:1.翹嘴鱖miRNA的鑒定及保守miRNA堿基編輯情況統(tǒng)計本研究通過HiSeq高通量測序?qū)βL組和快長組進行miRNA轉(zhuǎn)錄組測序,組裝、拼接后分別獲得11241781和11410753條干凈序列。與miRBase數(shù)據(jù)庫比對,一共獲得翹嘴鱖保守miRNA 433個,其中快長組有413個,慢長組410個。統(tǒng)計已知miRNA堿基編輯情況,結(jié)果顯示在快長組、慢長組中分別發(fā)生2336、2143處堿基編輯,其中出現(xiàn)次數(shù)較高的編輯類型是G-to-U與U-to-C,出現(xiàn)次數(shù)較低的編輯類型是C-to-U與C-to-A。miRNA編輯不僅增加了miRNA轉(zhuǎn)錄組的功能多樣性,也是轉(zhuǎn)錄組進化穩(wěn)定的特征。這些數(shù)據(jù)的獲得與分析豐富了鱖魚轉(zhuǎn)錄組信息。2.快長與慢長組差異表達miRNAs的鑒定與q-PCR驗證采用Expdiff方法在快長與慢長組間鑒定出8個差異miRNAs,進一步通過實時熒光定量qRT-PCR試驗驗證這些差異表達的miRNAs。其中miR-122、miR-192、miR-200b-5p、mi R-451在慢長組中顯著上調(diào);而let-7j-5p、mi R-499-5p、miR-10b-3p、miR-204-3p則在快長組中顯著上調(diào)。經(jīng)實時熒光定量RT-PCR方法驗證:miR-122、mi R-192、miR-451在慢長組中高表達,它們在兩組間均存在顯著差異(p0.05),與測序結(jié)果一致,但miR-200b-5p則為顯著低表達;驗證結(jié)果顯示let-7j-5p在快長組中也為高表達,但miR-499-5p、miR-10b-3p卻為低表達,其中l(wèi)et-7j-5p和miR-499-5p在兩組間均為顯著差異,而miR-10b-3p則為極顯著差異;miR-204-3p在兩組間則差異不顯著。這一結(jié)果為進一步了解miRNA對翹嘴鱖生長發(fā)育的調(diào)控提供基礎。3.差異表達miRNAs的靶基因預測及KEGG通路注釋利用軟件RNAhybrid和Targetscan對差異miRNA進行靶基因預測,將靶基因進行KEGG Pathway顯著性富集分析。取兩個軟件預測結(jié)果的交集,獲得36 065個miRNA-靶基因mRNA,分析miRNA-靶基因交互作用的遺傳多態(tài)性的數(shù)據(jù),以期對翹嘴鱖分子育種提供有用信息。mRNA經(jīng)KEGG富集分析可注釋到307個信號通路,這些通路涉及生長、代謝、發(fā)育等發(fā)面。其中Wnt信號通路是一個重要的魚類骨骼肌信號通路。4.qRT-PCR分析翹嘴鱖miR-192的胚胎表達模式miR-192是上述研究中發(fā)現(xiàn)的差異表達miRNA之一,通過實時熒光定量qRT-PCR對其胚胎表達模式進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-192為母源性表達基因,在未受精的魚卵中能檢測到表達,在受精卵到開口期表達量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢:在未受精卵、受精卵和多細胞期都有大量表達,之后在囊胚期其表達量急劇下降;從原腸胚期到肌肉效應期僅檢測到其極低表達量;而從出膜期到開口期表達急劇上升。miR-192可能在翹嘴鱖胚胎的分化發(fā)育過程起重要作用。
【圖文】：

圖 1 miRNA 合成示意圖Figure 1 miRNA biogenesis pathway（Farazi et el., 2013）第一階段（細胞核內(nèi)）① miRNA 基因由 RNA 聚合酶 II（RNase II）或 RNA 聚合酶 III（成具有 5’端帽子結(jié)構(gòu)、3’端 Poly（A）尾的初級轉(zhuǎn)錄物（pri-mimiRNA 序列較長，長度從數(shù)百到數(shù)千 nt 不等，有的是單順反子（單是多順反子（多發(fā)卡結(jié)構(gòu)）。pri-miRNA 進一步經(jīng) Drosha 酶剪切形環(huán)結(jié)構(gòu)的 miRNA 前體（pre-miRNA），這一過程通常需要迪格奧區(qū)蛋白 8（Dgcr8)和雙鏈 RNA 結(jié)合域蛋白的參與，有時還需要其它68/p53,KH 型剪切調(diào)控蛋白(KSRP)[9-11]。Drosha 酶是一種 RNA 內(nèi)鏈 RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、RNA 酶 III 結(jié)構(gòu)域和功能待定的 N 末端，’端進行磷酸化、3’端加入羥基[12]。因此，pre-miRNA 3’端有典型構(gòu)。②不經(jīng) Drosha 酶剪切，細胞核內(nèi)的 mRNA 通過剪切體作用剪切下

圖 2 miRNA 作用機制示意圖Figure2 Examples of miRNAmechanisms of action（Bizuayehu & Babiak, 2011）1.3.1 miRISC 與 mRNA 的相互作用機制miRNA 成熟體的 5’端 2-8 位高度保守，被稱作種子序列（seed se子序列是不完全互補配對的主要決定因素。目前，miRNA-靶 mRNA 相模型有：Seed matching：種子序列與靶基因 mRNA 的 3’-UTR 堿基配對matching：靶基因 mRNA 的 3’-UTR 不包含相應 miRNA 的種子序列，仍能與其部分堿基互補[27]、Centered paired site：mRNA 與 miRNA 的中11-12 個連續(xù)堿基配對[28]、Pivot pairing and transitional nucleation modesites[29]。1.3.2 miRNA 的調(diào)控細胞中，miRNA 的調(diào)控機制嚴謹而復雜。miRNA 調(diào)控可以劃分以下①轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控 miRNA 所處的基因組位置上的啟動子和miRNA 的轉(zhuǎn)錄。有些 miRNA 簇在一個基因簇中有多個啟動子，如人類
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2706004