【摘要】：集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖模式下,養(yǎng)殖魚類常出現(xiàn)肝脂質(zhì)代謝紊亂等問(wèn)題,作為世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量較大的淡水魚類,草魚(Ctenopharyngodon idella)養(yǎng)殖普遍采用投喂配合飼料的精養(yǎng)模式,其營(yíng)養(yǎng)需要及配方技術(shù)的研究雖已深入開展,但生產(chǎn)中仍經(jīng)常出現(xiàn)與飼料有關(guān)的糖脂代謝失調(diào)及肝脂質(zhì)代謝紊亂問(wèn)題,已嚴(yán)重影響到草魚品質(zhì)。本研究以高糖高脂飼料誘導(dǎo)的草魚脂肪肝為材料,通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù),篩選出差異表達(dá)的mi RNAs;利用mi RNAs預(yù)測(cè)軟件,預(yù)測(cè)魚類脂代謝特異mi RNAs的靶基因;利用q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)草魚脂代謝相關(guān)基因SREBP-1、PPARγ、ACC1、FAS、LPL、CPT-1的表達(dá)變化,并對(duì)篩選出的脂代謝相關(guān)mi R-33的靶基因進(jìn)行初步驗(yàn)證,以期闡明關(guān)鍵mi RNAs調(diào)節(jié)草魚肝脂代謝紊亂的作用機(jī)制。本研究從篩選調(diào)節(jié)肝脂代謝的關(guān)鍵mi RNAs入手,探討魚類肝臟脂肪代謝的標(biāo)志基因和mi RNAs的差異變化,旨在豐富魚類糖脂代謝理論,為提高草魚脂代謝利用能力、防治脂肪肝等營(yíng)養(yǎng)代謝疾病、促進(jìn)草魚健康養(yǎng)殖提供新的思路。1、高糖高脂飼料誘導(dǎo)草魚脂肪肝形成為探討投喂高糖高脂飼料對(duì)草魚肝臟脂肪蓄積的影響,本研究設(shè)計(jì)了4種等氮但糖脂含量水平不等的飼料,對(duì)照組(糖含量31%,脂肪含量4%)、高脂組(糖含量31%,脂肪含量8%)、高糖組(糖含量45%,脂肪含量4%)和高糖高脂組(糖含量45%,脂肪含量8%),用試驗(yàn)飼料飼喂草魚65天后,檢測(cè)草魚生長(zhǎng)指標(biāo)、飼料效率、蛋白質(zhì)效率及肝脂含量,對(duì)草魚是否形成脂肪肝進(jìn)行初步判斷。結(jié)果表明,草魚在攝食高糖高脂飼料后,其生長(zhǎng)性能、飼料效率、蛋白質(zhì)效率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P0.05);草魚的肝體比(HSI)、臟體比(VSI)與對(duì)照組相比也無(wú)顯著變化(P0.05);高糖高脂組的腸脂比(MFI)顯著高于對(duì)照組(P0.05),高糖組、高脂組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P0.05);高糖組、高脂組和高糖高脂組的肝脂含量均顯著高于對(duì)照組(P0.05),說(shuō)明高糖高脂飼料對(duì)草魚生長(zhǎng)影響不大,但引起了草魚肝臟脂肪的大量蓄積。用全自動(dòng)生化分析儀(AU-640,OLYMPUS)檢測(cè)血清中甘油三酯(Triglyceride,TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、球蛋白(Globulin,GLB)、總蛋白(Total protein,TP)等生化指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高糖高脂飼料誘導(dǎo)下,與對(duì)照組相比,AST/ALT、GLB、TP、TG等指標(biāo)升高,說(shuō)明肝臟功能已受到了一定影響,其中以高糖高脂組受到的損害最嚴(yán)重。顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,高糖組、高脂組和高糖高脂組的肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多,有的細(xì)胞腫大變形,說(shuō)明高糖高脂誘導(dǎo)不僅導(dǎo)致了肝臟脂肪的大量蓄積,還可能引起了肝臟功能的部分損傷。2、高通量測(cè)序技術(shù)篩選高糖高脂飼料誘導(dǎo)下差異表達(dá)的mi RNAs飼喂試驗(yàn)結(jié)束后,提取并分離草魚肝臟小RNA,構(gòu)建小RNA文庫(kù),采用Hiseq深度測(cè)序技術(shù),篩選出高糖高脂誘導(dǎo)下差異表達(dá)的mi RNAs。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,高糖組、高脂組、高糖高脂組分別有531、455和637個(gè)差異表達(dá)的mi RNAs,并初步確定了18個(gè)新的mi RNAs。3、熒光定量檢測(cè)高糖高脂對(duì)脂代謝基因和mi RNAs表達(dá)的影響以誘導(dǎo)的草魚肝為材料,實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)6種脂代謝相關(guān)基因和3種mi RNAs在不同處理下的表達(dá)量,結(jié)果顯示,脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1、PPARγ和脂肪生成酶基因ACC1、FAS的表達(dá)量均上調(diào),脂蛋白脂酶基因LPL表達(dá)量也上調(diào),脂肪氧化酶基因CPT-1表達(dá)量下調(diào),說(shuō)明高糖高脂誘導(dǎo)下,可引發(fā)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)響應(yīng)。3種mi RNAs(mi R-33、mi R-122、mi R-370)的表達(dá)均顯著上調(diào),與高通量測(cè)序結(jié)果一致。推測(cè)mi RNAs與糖脂代謝相關(guān)基因可能共同參與調(diào)節(jié)草魚糖脂代謝過(guò)程。4、草魚SREBP-1基因的克隆及mi R-33靶基因的預(yù)測(cè)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)是調(diào)控糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。為獲知草魚SREBP-1基因的序列,本實(shí)驗(yàn)采用同源克隆和RACE的方法獲得了草魚SREBP-1的部分c DNA序列,并通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)該基因及所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,對(duì)SREBP-1在8種不同組織中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究,利用mi RNAs預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)了mi RNAs在SREBP-1 3'非編碼區(qū)的作用靶位點(diǎn)。結(jié)果顯示:草魚SREBP-1的c DNA長(zhǎng)為4760 bp(Gen Bank登錄號(hào):KJ162572),其中開放讀碼框?yàn)?426 bp,編碼1141個(gè)氨基酸;3'非編碼區(qū)為1279 bp;草魚SREBP-1具有一個(gè)典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(b HLH-zip);氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,草魚SREBP-1與其他魚類的同源性達(dá)到76%-88%之間,與斑馬魚的進(jìn)化關(guān)系最近;草魚SREBP-1基因在腦中的表達(dá)量最高,肝臟和腸次之,在脾臟、腎臟、脂肪、肌肉和性腺中均有少量表達(dá);mi RNAs靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,SREBP-1的3'UTR區(qū)存在兩種與脂代謝相關(guān)的mi RNAs,即mi R-33和mi R-16。5、SREBP-1基因3'-UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建本研究成功構(gòu)建了SREBP-1 3'UTR熒光素酶報(bào)告基因載體,并驗(yàn)證了SREBP-13'UTR區(qū)包含了mi R-33的結(jié)合位點(diǎn),是mi R-33的候選靶基因。為下一步在細(xì)胞水平上對(duì)mi R-33的功能和作用機(jī)理進(jìn)行研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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2 蔣利和;吳宏玉;黃凱;麻艷群;楊淇齡;余德光;鐘靈香;;飼料糖水平對(duì)吉富羅非魚幼魚生長(zhǎng)和肝代謝功能的影響[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2013年02期

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本文編號(hào)：2696717