【摘要】：熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)是細(xì)胞在高溫及其他應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一類高度保守的蛋白質(zhì),HSPs作為一類重要的分子伴侶,從原核細(xì)胞到真核細(xì)胞都有表達(dá),在蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)性、降解中起重要作用。HSP90和HSP70是HSP家族最重要的成員,在各種應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,都具有抗細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫等功能。啟動(dòng)子是位于基因5’端的DNA序列,能被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合,啟動(dòng)子作為調(diào)控基因表達(dá)的重要順式元件,決定著基因的活動(dòng),因此啟動(dòng)子也日益成為研究的熱點(diǎn)。本研究是在課題組已有的雜色鮑HdHSP90的cDNA基因全長(zhǎng)及NCBI已公布的雜色鮑HdHSP70和HdHSC70基因cDNA序列的基礎(chǔ)上,通過Genome walker、Tail-PCR以及常規(guī)PCR等技術(shù)克隆獲得了這三個(gè)基因的5’調(diào)控區(qū)序列。并結(jié)合重組質(zhì)粒的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等方法,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平揭示雜色鮑HdHSP90、HdHSP70和HdHSC70基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1)通過Genome walker和Tail-PCR技術(shù),利用已知的序列分別新擴(kuò)增得到5’調(diào)控區(qū):雜色鮑HdHSP90基因2800 bp、HdHSC70基因2013 bp、HdHSP70基因2140 bp。2)生物信息學(xué)分析表明,這三個(gè)HSPs基因在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A)上游-30—-32 bp之間都存在一個(gè)TATA box,且在不同的位置都有一個(gè)CpG島,三者有很多共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),如:ATF、NF-1、TBP、Sp1、Oct-1、C/EBPalp等,并都有多個(gè)熱休克元件(HSE)。3)通過驗(yàn)證確定雜色鮑HdHSP90基因的核心啟動(dòng)子區(qū)位于-98 bp—+83 bp之間,HdHSC70基因核心啟動(dòng)子區(qū)位于-104 bp—+43 bp之間,HdHSP70基因的核心啟動(dòng)子區(qū)位于-189 bp—+46 bp之間。4)成功構(gòu)建了雜色鮑HSP90基因7個(gè)不同長(zhǎng)度缺失片段的啟動(dòng)子質(zhì)粒,活性分析表明:7個(gè)缺失片段的啟動(dòng)子活性都比較高,其中pGL-90-6r活性最高。通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的突變分析得知在-624 bp—-539 bp間的Oct-1、C/EBPalpha、NF-1這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都起到一定的抑制作用。5)成功構(gòu)建了雜色鮑HSC70基因7個(gè)不同長(zhǎng)度缺失片段的啟動(dòng)子質(zhì)粒,活性分析表明:不同長(zhǎng)度缺失片段的HdHSC70基因啟動(dòng)子活性除了pGL-c70-7r出現(xiàn)明顯的降低,且比pGL-c70-6r的活性有極顯著降低(P0.01)外,其余活性都很高。通過突變分析最短的兩個(gè)缺失片段之間的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜色鮑HSC70基因靠近-252 bp這一位置的ICSBP對(duì)雜色鮑HSC70基因的表達(dá)有一定的增強(qiáng)作用。6)成功構(gòu)建了雜色鮑HdHSP70基因7個(gè)不同長(zhǎng)度缺失片段的啟動(dòng)子質(zhì)粒,啟動(dòng)子活性分析表明,HdHSP70基因啟動(dòng)子活性也比較高,其中pGL-70-2r活性最高,顯著高于pGL-70-1r和pGL-70-3r的活性(P0.05)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),所有構(gòu)建的HdHSP70基因缺失片段的啟動(dòng)子的相對(duì)熒光活性普遍低于HdHSC70基因。
【圖文】：

SP90、HSC70 和 HSP70 基因啟動(dòng)子基本功能的初步研究5圖1.1 熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控模式圖1.3 啟動(dòng)子的研究基因的表達(dá)調(diào)控一直是人們研究的熱點(diǎn)之一，啟動(dòng)子作為調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件，決定著基因的活動(dòng)，因此啟動(dòng)子也日益成為研究的熱點(diǎn)[58]。啟動(dòng)子作為真核生物基因的重要組成部分，通常位于基因的5’ 端上游區(qū)的，RNA 聚合酶能夠識(shí)別并與之結(jié)合，啟動(dòng)子區(qū)有轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的位點(diǎn)，不同的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)轉(zhuǎn)錄有正或負(fù)的調(diào)節(jié)作用，根據(jù)這一特點(diǎn)，，可以使某些基因特異性表達(dá)或抑制，控制特定基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。從而調(diào)節(jié)機(jī)體一系列生理活動(dòng)。根據(jù)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄中調(diào)控能力的不同

集美大學(xué)碩士學(xué)位論文 雜色鮑 HSP90、HSC70 和 HSP70 基因啟動(dòng)子基本功能的初步第 2 章 材料與方法2.1 材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雜色鮑購(gòu)自福建省廈門市大嶝島。2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒載體感受態(tài)細(xì)胞 DH5α 是本實(shí)驗(yàn)室用原先保存的菌株所制備�？寺∷觅|(zhì)粒載體 pMD購(gòu)自 TaKaRa 公司。pGL3- Basic 質(zhì)粒 (含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因) 及 pRL-TK 內(nèi)參(含海腎螢光素酶報(bào)告基因)購(gòu)自 Promega 公司，實(shí)驗(yàn)所用的人胚胎腎 293FT 細(xì)胞株、pEGFP-N1 由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科研究所饋贈(zèng)。
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2684726