【摘要】：斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖品種之一,在世界上同樣占有重要的地位,在有關斑節(jié)對蝦的研究上,性腺發(fā)育調(diào)控的研究受到了眾多學者的關注。同時,繼基因組學之后蛋白質(zhì)組學研究成為了分子生物學研究的熱點之一,蛋白組學技術已被廣泛應用到養(yǎng)殖生物的分子生物學研究中。目前,有關斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的蛋白質(zhì)組學研究仍較少,斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機制不明確。所以本研究運用蛋白質(zhì)組學和基因組學方法對斑節(jié)對蝦不同發(fā)育時期卵巢進行了研究,為進一步探明斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機制提供更多的基礎數(shù)據(jù)。本研究以斑節(jié)對蝦不同發(fā)育時期卵巢為研究對象,采用雙向電泳技術對卵巢發(fā)育表達蛋白進行分離并篩選出差異表達蛋白點;然后對篩選得到的差異點進行了質(zhì)譜分析,將質(zhì)譜結果結合實驗室已開展的斑節(jié)對蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組篩選相關基因進行克隆表達;同時從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出與卵巢發(fā)育相關的泛素融合蛋白基因片段Pm Ub S27、Pm Ub L40,進行了克隆和在卵巢不同發(fā)育時期的表達分析,相關結果如下:(1)構建了適合于斑節(jié)對蝦卵巢組織蛋白的雙向電泳技術體系,得到了分辨率高、重復性好的斑節(jié)對蝦發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期卵巢組織蛋白表達圖譜。(2)通過斑節(jié)對蝦卵巢組織蛋白表達圖譜研究了卵巢發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期蛋白質(zhì)表達的變化,結果顯示卵巢發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期蛋白質(zhì)分別獲得了4147、4125、3972個蛋白點,其中Ⅱ、Ⅲ期表達差異蛋白點418個,Ⅲ、Ⅳ期表達差異蛋白點460個。其中Ⅱ期到Ⅲ期相比有159個蛋白點表達上調(diào),259個蛋白點表達下調(diào);Ⅲ期到Ⅳ期相比有181個蛋白點表達上調(diào),279個蛋白點表達下調(diào)。同時在三個時期中共同表達且表達上調(diào)或下調(diào)的蛋白點分別有19、146個,從中選取了18個表達量差異2倍及以上的蛋白點,成功鑒定出12種蛋白,其中上調(diào)蛋白有卵黃蛋白原、β-肌動蛋白,表達下調(diào)的蛋白有血藍蛋白、吡咯啉-5-羧酸還原酶(delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase,mitochondrial,Pm P5CDh)、原肌球蛋白、前列腺素還原酶1、白介素結合增強因子3同系物x4亞型、肌動蛋白1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,Pm GST)、β-微管蛋白、延長因子1-α。(3)根據(jù)質(zhì)譜鑒定結果,從鑒定的12種蛋白中篩選了線粒體吡咯啉-5-羧酸還原酶(Pm P5CDh)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Pm GST)進行了研究,從m RNA水平檢測了Pm P5CDh和Pm GST在斑節(jié)對蝦不同組織中和卵巢發(fā)育各時期的表達水平,結果顯示Pm P5CDh基因在斑節(jié)對蝦肌肉組織中表達量最高,其次為腦神經(jīng),在其他各組織中表達無顯著性差異。Pm GST基因在斑節(jié)對蝦精巢和血淋巴中表達量最高,其次為胸腹神經(jīng)、肝胰腺和卵巢。在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育各時期的表達中,Pm P5CDh基因呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn),在卵巢發(fā)育Ⅲ期表達量達到最高。Pm GST基因在卵巢發(fā)育過程中呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,但在Ⅳ期表達異常,表達量最小,在Ⅴ期達到最大值。(4)泛素融合蛋白Pm Ub S27、Pm Ub L40基因c DNA序列全長分別為506bp、571bp,分別編碼154個、129個氨基酸的蛋白;在各組織中均有表達。兩個泛素核糖體蛋白是由氮末端的泛素結構域和碳末端的核糖體蛋白結構域組成。實時定量結果顯示,Pm Ub S27基因在卵巢中表達量顯著高于其他組織,并且在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達量最高。Pm Ub L40基因在肝胰腺中表達量最高,其次為肌肉和卵巢,且在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達量最高。通過對上述實驗結果的分析,初步探討了斑節(jié)對蝦不同發(fā)育時期蛋白的表達情況,并得到了卵巢發(fā)育調(diào)控相關的蛋白基因,表明這些基因?qū)τ诎吖?jié)對蝦卵巢的發(fā)育具有一定的作用,對進一步闡明斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機理提供了理論基礎。
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中國對蝦卵巢結構示意圖（孫修濤，1意卵巢結構 (b)示意卵巢第 6 側(cè)葉橫f the ovary of the female prawn Fenneropetructure of ovary (b)The sixth ovarian sid

圖 1.2 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的基本流程Fig.1.2 The basic process of protein mass spectrometry電噴霧電離質(zhì)譜將液相離子轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嚯x子而進行 MS 分析。電噴霧電離電荷殘余原理[25-26]，是樣品溶液在電場及輔助氣流的作用下噴成霧狀帶揮發(fā)性溶液在高溫下逐漸蒸發(fā)，液滴表面的電荷體密度隨半徑的減小而增
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2680057