【摘要】：鮑皰疹病毒(Abalone Herpes Virus,AbHV),赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒(Redspotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)和牡蠣皰疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)是對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物危害較嚴(yán)重的3種病毒,目前沒有有效的治療方法。海水養(yǎng)殖病害防控“以防為主”。國內(nèi)外在水產(chǎn)疫病診斷技術(shù)方面,已經(jīng)建立了各種常見水產(chǎn)疫病病原的檢測(cè)方法,如PCR、qPCR、LAMP、抗原抗體檢測(cè)、核酸雜交檢測(cè)等。本研究針對(duì)上述3種病毒分別設(shè)計(jì)了合適的引物和探針,用熒光定量重組酶聚合酶擴(kuò)增(Quantitative Recombinase polymerase amplification,qRPA)的方法進(jìn)行檢測(cè),通過與熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)比較來評(píng)估qRPA試驗(yàn)方法的靈敏度和特異性。結(jié)果顯示:qRPA對(duì)AbHV檢測(cè)的靈敏度為100拷貝,反應(yīng)時(shí)間僅為20±0.50分鐘;在對(duì)疑似感染AbHV的雜色鮑(Haliotis diversicolor)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí),qRPA和qPCR對(duì)AbHV的檢測(cè)率分別為96%和93%。qRPA對(duì)RGNNV檢測(cè)的靈敏度為100拷貝,反應(yīng)時(shí)間為20±0.50分鐘;檢測(cè)疑似感染RGNNV的石斑魚(Epinephelussp)樣品時(shí),qRPA和qPCR對(duì)RGNNV的檢測(cè)率分別為97%和95%。在對(duì)OsHV-1進(jìn)行檢測(cè)時(shí),以O(shè)RF95為模板設(shè)計(jì)的引物和探針可以檢測(cè)到5拷貝的DNA,遠(yuǎn)高于本研究所采用的qPCR檢測(cè)的靈敏度(100拷貝);qRPA和qPCR檢測(cè)疑似感染OsHV-1的毛蚶(Scapharca subcrenata)樣品時(shí),對(duì)OsHV-1的檢測(cè)率都是22%。另外,利用qPPA和qPCR分別對(duì)感染三種病毒的樣品進(jìn)行驗(yàn)證時(shí),檢測(cè)結(jié)果之間均呈現(xiàn)出較好的相關(guān)性,R~2均大于0.8。Whatman FTA卡是一種可以在室溫下對(duì)各種生物樣品進(jìn)行收集、運(yùn)輸、存檔和核酸純化的濾膜設(shè)備。本研究使用FTA卡提取感染GNNV的石斑魚腦組織中的RNA,運(yùn)用RT-PCR方法成功檢測(cè)出了RGNNV。這種提取方式大大簡化了病毒提取的步驟,節(jié)約時(shí)間和成本。為了使檢測(cè)結(jié)果可視化,本研究中還嘗試了用RPA結(jié)合橫向流動(dòng)試紙條(Lateral flow dipstick,LFD)的方法檢測(cè)AbHV、RGNNV和OsHV-1,并驗(yàn)證該方法的靈敏度。3種病毒陽性質(zhì)粒的反應(yīng)時(shí)間為5 min時(shí),LFD對(duì)它們的檢測(cè)限分別是10拷貝、10拷貝、100拷貝。本研究還利用qPCR方法檢測(cè)了15個(gè)沿海城市的毛蚶樣品中的OsHV-1感染情況,對(duì)毛蚶中OsHV-1的地域分布以及感染率的情況有了深入了解。流行病調(diào)查結(jié)果顯示,除了深圳、大連、連云港和南通地區(qū)采集的毛蚶檢測(cè)到OsHV-1外,其他地區(qū)均未檢測(cè)到該病毒。
【圖文】：

圖 1-1 從 2000-2017 年，web of science 上收錄的各種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的文獻(xiàn)數(shù)ig.1-1 From 2000 to 2017 year, the number of articles on various isothermal amplificationincluded in the web of science通過統(tǒng)計(jì)在 Web of Science 收錄的有關(guān)等溫?cái)U(kuò)增的文獻(xiàn)數(shù)（圖 1-1），可 LAMP 是近幾年應(yīng)用最多的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，RPA 是另具有很大潛力的檢測(cè)技術(shù)，近幾年逐漸在生科科學(xué)、食品安全等檢測(cè)領(lǐng)域角。雖然相對(duì)其他幾種檢測(cè)方法，，該技術(shù)問世較晚，但卻是近年來生命科研究的熱點(diǎn)。下面就這兩種技術(shù)的反應(yīng)原理及其應(yīng)用情況進(jìn)行探討。LAMP 研究進(jìn)展 擴(kuò)增原理LAMP 技術(shù)主要是通過設(shè)計(jì)兩條特異的外部引物和兩條特異的內(nèi)部引物

引物特異性檢測(cè)電泳圖。1-8：陰性對(duì)照，陽性對(duì)照，卵形鯧湽基因組DNA，感染 WSSV 的南美白對(duì)蝦的基因組 DNA，東風(fēng)螺基因組 DNA，菌基因組 DNAecificity assays of RPAdetection. lane 1-8: negative control, positive controachinotus ovatus, genomic DNAof Crassostrea gigas, genomic DNA of Peinfected with WSSV, genomic DNA of Babylonia areolata, water DNA anderomonas hydrophila. 檢測(cè) AbHV 的靈敏度和重復(fù)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)10倍梯度稀釋，選取 107~10的稀釋濃度進(jìn)行q曲線。以重組質(zhì)�？截悢�(shù)對(duì)數(shù)值為 X 軸，以 Ct 值為 Y 軸，得式為 Y = －4.38X + 33.49，如圖 2-2 所示，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)2）為 0.9036，擴(kuò)增效率（E）為 100%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)批次間
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S941.41

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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2 汪琳;羅英;周琦;賴平安;柏亞鐸;;核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2011年02期

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本文編號(hào)：2672633