【摘要】：脊椎動(dòng)物精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程,睪丸精原細(xì)胞要經(jīng)歷有絲分裂、減數(shù)分裂,最終分化并發(fā)育為精子。睪丸由許多曲精小管及間質(zhì)組成,每一曲精小管又由各級(jí)生精細(xì)胞和唯一的上皮細(xì)胞一支持細(xì)胞(又稱哺育細(xì)胞)組成。在生精過程中,支持細(xì)胞發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。研究支持細(xì)胞與生精細(xì)胞之間的交互聯(lián)系,對(duì)于理解睪丸組織結(jié)構(gòu)和支持細(xì)胞與生精細(xì)胞間生理學(xué)關(guān)系至關(guān)重要。在低等脊椎動(dòng)物中闡明這類細(xì)胞間的關(guān)系有助于從進(jìn)化和發(fā)育的角度探究支持細(xì)胞與生精細(xì)胞間的相互關(guān)系。目前,對(duì)于支持細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)研究主要在哺乳動(dòng)物中,非哺乳類的研究較少。中華鱉是分布于我國(guó)和亞洲其它國(guó)家的一類古老的爬行動(dòng)物,可作為食用,是爬行類養(yǎng)殖規(guī)模最大的動(dòng)物,具有極高的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。盡管爬行動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞的研究已有一些報(bào)道,但是其大部分的結(jié)構(gòu)與功能仍不清楚。少有文獻(xiàn)報(bào)道爬行類動(dòng)物相鄰支持細(xì)胞之間以及支持細(xì)胞和生精細(xì)胞之間的連接復(fù)合體,在龜鱉類物種中則更為罕見。另一方面,爬行動(dòng)物睪丸的某些功能需要進(jìn)一步明確。季節(jié)性生殖動(dòng)物中,支持細(xì)胞經(jīng)歷脂質(zhì)循環(huán),但是,在整個(gè)生精過程中支持細(xì)胞中的脂質(zhì)的利用卻不清楚。排精后,支持細(xì)胞可以吞噬殘余體或者是殘余的精子,但具體的機(jī)制仍不清楚。本文揭示了中華鱉睪丸支持細(xì)胞在生殖過程中形態(tài)學(xué)的季節(jié)性變化特點(diǎn),隨后,進(jìn)一步研究支持細(xì)胞在生精細(xì)胞發(fā)育中的作用,并解析生精過程中生精細(xì)胞的發(fā)育策略。重要的是,本文首次在睪丸支持細(xì)胞中探究脂滴自噬在脂滴分解中的作用;揭示生精過程中支持細(xì)胞之間的緊密連接和縫隙連接的特點(diǎn)。本研究闡釋了支持細(xì)胞的一個(gè)新異的細(xì)胞學(xué)機(jī)制,即在冬眠期,支持細(xì)胞可以通過內(nèi)化和自噬途徑清除睪丸曲精小管中殘余的精子,這對(duì)于中華鱉睪丸下一次生殖周期的進(jìn)行必不可少。綜上所述,本文詳細(xì)研究了支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),并且發(fā)現(xiàn)了支持細(xì)胞對(duì)生精細(xì)胞發(fā)育的全新功能;在細(xì)胞水平上首次發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞的脂滴自噬和內(nèi)化作用。試驗(yàn)Ⅰ生殖周期中中華鱉支持細(xì)胞及其與生精細(xì)胞的聯(lián)系支持細(xì)胞在睪丸生精細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用,在整個(gè)生精過程中表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡、透射電鏡和免疫組織化學(xué)法觀察了中華鱉生殖周期中睪丸支持細(xì)胞的形態(tài)變化特點(diǎn)。在生精過程停止的冬眠期,支持細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了自噬小體。生精早期,生精細(xì)胞開始增殖,支持細(xì)胞中含有許多的脂滴。生精晚期,支持細(xì)胞變得狹長(zhǎng)并包繞著若干圓形或細(xì)長(zhǎng)的精子細(xì)胞。同時(shí),支持細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。支持細(xì)胞和生精細(xì)胞之間的緊密連接和黏著連接隨著生殖周期而發(fā)生變化。生精過程中支持細(xì)胞常與胞質(zhì)橋的形成、吞噬泡(自噬體前膜)以及外泌體形成有關(guān)。支持細(xì)胞也與排精時(shí)期圍繞在精子細(xì)胞頭部管狀小葉復(fù)合體的形成有關(guān)。與冬眠期和生精早期相比,在生精后期波形蛋白顯著分布于支持細(xì)胞。研究結(jié)果闡明了支持細(xì)胞在雄性中華鱉生殖周期性中變化規(guī)律。試驗(yàn)Ⅱ中華鱉睪丸支持細(xì)胞間緊密連接和縫隙連接的特性研究精子發(fā)生過程中,早期發(fā)育中的生精細(xì)胞必須由曲精小管基底部到達(dá)管腔處,這與連接復(fù)合體的大量重建相關(guān)。然而關(guān)于爬行動(dòng)物中這些連接復(fù)合體卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)觀察了中華鱉睪丸支持細(xì)胞之間緊密連接蛋白(CLDN11)和縫隙連接蛋白(Cx43)在生精過程中的表達(dá)規(guī)律。生精早期,CLDN11免疫陽性反應(yīng)較弱,Cx43在支持細(xì)胞管腔部位點(diǎn)狀分布而在靠近基底部位則較少。生精晚期,CLDN11和Cx43在支持細(xì)胞連接處以及初級(jí)精母細(xì)胞靠近支持細(xì)胞基底部位處廣泛分布。在晚期,CLDN11和Cx43蛋白表達(dá)顯著下降,僅僅分布于支持細(xì)胞周圍以及精母細(xì)胞基底部。透射電鏡顯示,在精子發(fā)生的中期支持細(xì)胞之間的緊密連接位于支持細(xì)胞的基底部位。而縫隙連接在整個(gè)生精過程中位于支持細(xì)胞之間、支持細(xì)胞與精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞之間。在生精過程中也觀察到了黏著連接和半橋粒。上述結(jié)果表明,緊密連接和縫隙連接隨著生精時(shí)期的不同而發(fā)生相應(yīng)變化,這可能與生精細(xì)胞的發(fā)育分化有關(guān)。試驗(yàn)Ⅲ生精過程中中華鱉支持細(xì)胞脂滴自噬的細(xì)胞學(xué)研究精子的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過程,支持細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成對(duì)于維持正常的生精是必不可少的。但是,其內(nèi)部脂滴的利用過程卻不清楚。中華鱉睪丸精原細(xì)胞在5月份開始增殖,減數(shù)分離期主要在7月,10月份曲精小管中分布大量的生精細(xì)胞。透射電鏡和油紅O染色表明5月份支持細(xì)胞中分布有大量的脂滴。有些脂滴附著到分離膜上面,表明脂滴可能是自噬小體生成的內(nèi)生性能量來源之一。5月份脂滴被包裹在自噬小體內(nèi),然而10月份支持細(xì)胞中自噬小體和線粒體可直接與脂滴接觸。免疫組織化學(xué)表明,支持細(xì)胞中LC3的表達(dá)在5月份強(qiáng)于10月份。本試驗(yàn)首次表明支持細(xì)胞中脂滴自噬對(duì)脂滴積累的兩種不同作用方式,這是生精過程中支持細(xì)胞和生精細(xì)胞聯(lián)系的關(guān)鍵方面。試驗(yàn)Ⅳ內(nèi)化作為一種新途徑參與睪丸支持細(xì)胞的精子清除本試驗(yàn)在體研究發(fā)現(xiàn)冬眠期中華鱉睪丸曲精小管中殘余的精子可以被內(nèi)化途徑清除。Western blot表明冬眠期LAMP 1的蛋白表達(dá)水平比非冬眠期顯著升高。免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)LAMP 1陽性表達(dá)主要分布于睪丸支持細(xì)胞。透射電鏡進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),支持細(xì)胞中許多被降解的精子包繞在大的內(nèi)吞泡內(nèi)。有些精子的細(xì)胞核和鞭毛在支持細(xì)胞的內(nèi)吞小體中被降解。有時(shí)一個(gè)內(nèi)吞泡內(nèi)包含了多個(gè)精子。值得注意的是,冬眠期支持細(xì)胞的內(nèi)吞泡中含有不同類的自噬小體,包括:初級(jí)的自噬膜泡、降解中的自噬小體等。在冬眠末期,支持細(xì)胞的內(nèi)吞小泡和自噬小體被大量的脂滴替代。支持細(xì)胞與生精細(xì)胞之間具有粘著連接,而此結(jié)構(gòu)是支持細(xì)胞內(nèi)吞途徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。結(jié)果表明:1、冬眠期在體細(xì)胞可以發(fā)生內(nèi)化現(xiàn)象,且自噬協(xié)助內(nèi)化物質(zhì)的降解;2、作為高度分化的細(xì)胞—精子可以被支持細(xì)胞內(nèi)化降解,這有利于雄性中華鱉下一個(gè)生殖周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2669003