發(fā)布時間：2020-05-17 01:21

【摘要】：LGR8是胰島素樣因子3(INSL-3)在體內(nèi)的特異性受體,屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)大家族。哺乳動物中LGR8高表達于睪丸引帶等組織;在人類研究中發(fā)現(xiàn)編碼LGR8和INSL-3的兩個基因分別控制著哺乳動物雄性器官下降所必需的腹股溝韌帶和索狀引帶的分化發(fā)育。目前一般認為,LGR8或INSL-3的突變有可能導致隱睪癥的發(fā)生。本實驗在對半滑舌鰨全基因組測序與轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上,通過RACE的方法克隆得到了半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)LGR8基因全長,該基因全長為2768bp,共編碼734個氨基酸。對其進行實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,在成熟性腺中,LGR8在雄性中主要在腦、性腺中表達;在雌魚體內(nèi)各組織中表達無顯著差異,且雄魚性腺和腦中的表達量要顯著高于雌魚;通過對不同時期的性腺進行實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,LGR8基因在魚體發(fā)育80天左右表達量開始上升,150d~210d表達量達到最大,這表明LGR8在半滑舌鰨性別決定和性腺發(fā)育中起到一定的作用。CSW3是本實驗室在對半滑舌鰨基因組測序與轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上克隆得到的半滑舌鰨特有且在雌性性腺中高表達的基因,我們通過RACE技術(shù)克隆得到了半滑舌鰨CSW3基因c DNA全長。CSW3 c DNA基因全長為1714bp,其中5端非翻譯區(qū)長173bp,3端非翻譯區(qū)長929bp,編碼區(qū)為612bp,編碼共204個氨基酸。通過定量PCR實驗結(jié)果表明,CSW3基因為組織廣譜性表達,且在卵巢中表達最高。實驗通過分析CSW3重組蛋白注射性腺后Dmrt1、Sox9、Amh、P450等性別決定相關(guān)基因的表達調(diào)控,探討CSW3在半滑舌鰨性別決定與分化中的作用。重組蛋白注射半滑舌鰨性腺后實時定量PCR分析結(jié)果顯示,Dmrt1、Sox9、Amh、P450等基因的表達量有不同程度的上調(diào)和下調(diào),證明了CSW3蛋白具有一定的活性,可能一定程度上在性別決定中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖 2-1 半滑舌鰨雌雄魚個體性腺細胞(A 為雄魚，B 為雌魚)Fig 2-1 The natural ovary and testis in half smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis).4.4.2 PCR 驗證遺傳性別用合成的性別鑒定引物進行 PCR 擴增，PCR 擴增體系為 15.0μL。PCR 結(jié)束后通糖凝膠電泳進行檢驗，遺傳雄性為一條帶，遺傳雌性為兩條帶(具體實驗步驟參考本.4.1.1 和 2.4.1.2)。.4.5 LGR8 基因?qū)崟r定量 PCR 表達分析實時熒光定量 PCR 是指在 PCR 反應過程中加入帶熒光物質(zhì)，使其結(jié)合在 DNA 雙定位置上，利用熒光信號的大小實時監(jiān)測 PCR 進程和反應量的變化，再通過制作標對實驗模板實現(xiàn)定量分析的方法。根據(jù)得到的半滑舌鰨 LGR8 基因的編碼區(qū)序列，， 對表達分析引物 1339 LGR8-F 和 1476 LGR8-R 詳見表 2-1 進行實時定量 PCR (ReaCR)。以 β-actin 為內(nèi)參進行實時定量分析。實驗將 3 齡半滑舌鰨不同組織，包括腦、腸、腎、心臟、脾臟、血液進行了定量分析，同時對不同時期半滑舌鰨性腺，包括

小方框內(nèi)為翻譯起始位點和終止位點，長方框內(nèi)為 7tm-1 結(jié)構(gòu)域，下劃線為 LDL-A 區(qū)域，為 LRRs 區(qū)域Fig.2-2 ORF sequence and deduced amino acid sequence of LGR8 in half smooth tongue-sole. Tlocus (ATG) and the terminal locus (TGA) are boxed in the short frame and the 7tm-1 motif is boxlong frame. LDL-A is underlined. The LRRs sequences are indicated in the shadow.
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2667678