【摘要】：普通草魚(Ctenopharyngodon idellus)攝食單一餌料蠶豆(Vicia faba)120 d后,可成為風味獨特的脆肉鯇,目前已成為廣東省中山市東升鎮(zhèn)的特色產業(yè),且消費范圍也由廣東逐漸覆蓋至全國。但是,在脆肉鯇養(yǎng)殖生產過程中常出現(xiàn)的“半脆”、“過脆”和“腫身病”死亡的現(xiàn)象,曾一度難倒眾多養(yǎng)殖戶,至今對草魚脆化時的生理病理變化過程仍不清楚。為此,本文首先進行肌肉脆化特性分析,再從腸道菌群組成與血清免疫酶活性、頭腎與肝臟的超微結構、溶菌酶等免疫基因的定量表達3個方面,綜合探討草魚在不同脆化階段的生理生化狀況,以期闡明脆肉鯇的免疫健康狀態(tài),進而為脆肉鯇的健康養(yǎng)殖提供科學的指導資料。具體研究內容如下:1.本研究首先檢測草魚肌肉脆化效果,為后續(xù)脆肉鯇免疫機能的研究做準備。結果顯示,脆化120 d時,蠶豆組草魚肌纖維直徑比對照組減少了28.12%(P0.01),肌纖維密度增加了99.14%(P0.01)。脆化120 d時,蠶豆組草魚肌肉硬度、彈性、咀嚼性、內聚性和膠黏性分別比對照組增加了39.76%(P0.01)、37.20%(P0.01)、92.82%(P0.01)、30.43%(P0.01)和68.17%(P0.01)。實驗結果發(fā)現(xiàn),不同時期攝食蠶豆的草魚肌纖維直徑逐漸減小、肌纖維密度逐漸增大、肌肉硬度與彈性等逐漸增大,表明已獲得不同脆化程度的脆肉鯇。2.檢測不同脆化階段草魚腸道菌群組成結構、血清酶活性及生長性能,進而衡量脆肉鯇形成過程中的生理生化變化。結果顯示,60~150 d蠶豆組草魚體重均低于對照組,90~120 d蠶豆組草魚頭腎體指數(shù)和肝體指數(shù)均低于對照組,150 d時蠶豆組草魚肝體指數(shù)與對照組無顯著差異;蠶豆組草魚血清堿性磷酸酶、溶菌酶和補體C3(第30天除外)活性均低于對照組的,在轉投喂飼料后,3種血清酶活性均出現(xiàn)回升趨勢;與對照組相比,蠶豆組草魚腸道菌群多樣性降低,芽胞桿菌屬(Bacillus)和鯨桿菌屬(Cetobacterium)等有益菌數(shù)量減少,維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)等條件致病菌數(shù)量增多。兩組草魚腸道核心菌群主要為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和梭桿菌門(Fusobacteria)。本研究結果表明,隨著脆化時間的增加,飼喂蠶豆改變草魚腸道菌群組成、抑制血清酶活性和生長性能,在脆化120 d轉投飼料后(蠶豆組第150 d時)其腸道菌群、血清酶活性及生長性能均有所改善。3.為了探究投喂蠶豆對草魚免疫相關組織結構的影響,本研究還觀察了不同脆化階段草魚頭腎、肝臟和腸道的超微結構變化。超微結構分析結果顯示,蠶豆組草魚頭腎細胞出現(xiàn)空泡;脆化后期頭腎細胞受損,出現(xiàn)組織壞死區(qū)域。蠶豆組草魚肝臟細胞逐漸腫大,線粒體和內質網(wǎng)數(shù)量逐漸減少,并雜亂的分布在細胞質中,竇周隙出現(xiàn)不同程度的損傷,表現(xiàn)為肝細胞微絨毛和內皮細胞損壞或缺失;脆化后期,肝細胞核形狀異常,血竇形態(tài)結構紊亂。蠶豆組草魚腸道粘膜上皮出現(xiàn)炎癥,表現(xiàn)為微絨毛逐漸稀疏、變短,受到損傷;脆化后期粘膜上皮部分區(qū)域微絨毛消失,細胞間緊密連接暴露,上皮細胞表面遭到損壞。本研究結果表明,投喂蠶豆對草魚頭腎、肝臟和腸道組織結構的影響是一個逐漸變化的過程,隨著脆化時間的延長,免疫相關組織結構的損壞越嚴重。4.最后,本實驗在基因水平定量檢測了投喂蠶豆對草魚頭腎和肝臟組織中C型溶菌酶(C-type lysozyme)、白介素1β(IL-1β)、干擾素I型(IFN-I)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、免疫球蛋白M(Ig M)和主要組織相容性復合體I(MHC-I)6種免疫基因表達的影響。結果顯示,蠶豆組草魚頭腎中C-type lysozyme、IFN-I、Ig M和MHC-I的表達、肝臟中IFN-I、TNF-α、Ig M和MHC-I的表達在草魚攝食蠶豆期間顯著下調;在轉投飼料30 d后(蠶豆組第150 d時),除蠶豆組草魚頭腎C-type lysozyme外,上述蠶豆組草魚基因的表達皆呈現(xiàn)回升趨勢。本研究結果表明,投喂蠶豆對草魚頭腎和肝臟組織中免疫基因的表達產生了一定的抑制作用,轉投飼料30 d后(蠶豆組第150 d時)可以使受到抑制的免疫基因的表達有所恢復�？傊�,脆化120 d的草魚,繼續(xù)攝食30 d的人工配合飼料,其肌肉脆化效果并未受到影響。投喂蠶豆后,草魚腸道菌群多樣性及有益菌數(shù)量減少、血清免疫酶活性受到抑制、免疫相關組織超微結構損傷、免疫基因的表達受到抑制,而脆化結束時轉投人工配合飼料30 d后,脆肉鯇的免疫機能有所改善。本論文研究結果為脆肉鯇規(guī)�；s養(yǎng)殖和降低長途運輸中脆肉鯇的應激反應提供了科學指導資料和理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 肌肉的橫切與縱切顯微結構(×400 倍)Fig.1-1 Transection and vertical section of muscle(×400 times))：對照組橫切；(b)：蠶豆組 30 d 橫切；(c)：蠶豆組 60 d 橫切；(d)：蠶豆組 90 d 橫切；(e)：蠶豆組 12切；(f)：蠶豆組 150 d 橫切；(g)：對照組縱切；(h)：蠶豆組 30 d 縱切；(i)：蠶豆組 60 d 縱切；(j)：蠶組 90 d 縱切；(k)：蠶豆組 120 d 縱切；(l)：蠶豆組 150 d 縱切(a): Transection of muscle of control; (b): Transection of muscle of broad bean (BB) (30 d); (c): Transection omuscle of BB (60 d); (d): Transection of muscle of BB (90 d); (e): Transection of muscle of BB (120 d); (f):Transection of muscle of BB (150 d); (g): Vertical section of muscle of control; (h): Vertical section of muscle BB (30 d); (i): Vertical section of muscle of BB (60 d); (j): Vertical section of muscle of BB (90 d); (k): Verticasection of muscle of BB (120 d); (l): Vertical section of muscle of BB (150 d).2 不同脆化階段草魚肌纖維直徑和密度的比較表 1-1 所示，脆化 30 d 時，蠶豆組草魚與對照組草魚的肌纖維直徑和密度既已存在顯差異(P<0.05)，與對照組相比，蠶豆組草魚肌纖維直徑減少了 15.66%(P<0.01)，肌纖維密加了 56.03%(P<0.01)；在蠶豆組草魚攝食蠶豆期間，每個脆化階段的肌纖維直徑和密度較一階段都有所增加；脆化 120 d 時，，蠶豆組草魚肌纖維直徑比對照組減少了 28.12%(P<0.0纖維密度增加了 99.14%(P<0.01)；轉投飼料 30 d 后(蠶豆組第 150 d 時)的蠶豆組草魚肌纖徑和密度與脆化 120 d 的蠶豆組草魚之間無顯著性差異(P>0.05)。

上海海洋大學碩士學位論文18圖2-2 (a)不同脆化階段草魚血清堿性磷酸酶活性的變化 (b)不同脆化階段草魚血清溶菌酶活性的變化 (c)不同脆化階段草魚血清補體C3含量水平Fig.2-2 (a)The activity of serum alkaline phosphatase of grass carp at different crisping stages (b)The activity ofserum lysozyme of grass carp at different crisping stages (c)The levels of serum complement C3 of grass carp atdifferent crisping stages2.3 草魚腸道菌群 PCR-DGGE 圖譜構建及序列分析2.3.1 基因組 DNA 提取和 PCR 擴增提取草魚腸道微生物總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后得到23 kb的DNA條帶(如圖 2-3、2-4)，雖出現(xiàn)部分降解，但基本能滿足后續(xù)實驗的需要。圖2-3 不同養(yǎng)殖時期對照組草魚基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2-3 Agarose gel(1%) electrophoresis of genomic DNA of control group in different times1~3：對照組30 d；4~6：對照組60 d；7~9：對照組90 d；10~12：對照組120 d；13~15：對照組150 d。1~3: Control (30 d); 4~6: Control (60 d); 7~9: Control (90 d); 10~12: Control (120 d); 13~15. Control (150 d).
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S965.112

【參考文獻】

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本文編號：2666611