【摘要】：擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類之一。近年來,青蟹的人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,但在青蟹的人工育苗和養(yǎng)殖過程中因容易受水質(zhì)、微生物感染等導(dǎo)致存活率仍較低,同時養(yǎng)殖業(yè)抗生素藥品的大量使用使病原微生物的耐藥性不斷增加,這些都極大地限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此對青蟹免疫機(jī)制的研究具有十分重要的意義。酚氧化酶系統(tǒng)是無脊椎動物特有的一套非自身識別免疫系統(tǒng),尤其是在節(jié)肢動物的免疫機(jī)制中具有非常重要的作用。血藍(lán)蛋白是一類在節(jié)肢動物和軟體動物中負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧氣的含銅呼吸蛋白。近年來很多研究表明節(jié)肢動物的血藍(lán)蛋白和酚氧化酶具有同源關(guān)系,結(jié)構(gòu)上非常相似,且在一定條件下血藍(lán)蛋白又具有酚氧化酶活性。本研究主要通過構(gòu)建擬穴青蟹的c DNA文庫,借助c DNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)和實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對擬穴青蟹酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的兩個相關(guān)基因以及血藍(lán)蛋白基因進(jìn)行了克隆和不同模式下的表達(dá)分析,并利用生物信息學(xué)的方法對獲得的序列進(jìn)行了分析研究,試圖從分子生物學(xué)的角度來探討這些基因之間的關(guān)系以及它們在擬穴青蟹免疫過程中的作用,以期為緩解擬穴青蟹養(yǎng)殖業(yè)的病害問題提供重要的理論基礎(chǔ)。本文主要研究結(jié)果總結(jié)如下:1、酚氧化酶原激活酶(PPAF)是一類含有clip結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶,可以激活無活性的酚氧化酶原(pro PO),從而引起病原菌的黑化反應(yīng),是酚氧化酶系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。本文克隆到了擬穴青蟹PPAF1和PPAF2兩個基因的c DNA全長,比對結(jié)果顯示它們與其他物種的PPAF具有較高的同源性,綜合分析后分別命名為Sp PPAF1和Sp PPAF2。Sp PPAF1序列c DNA全長為1677bp,其中包括52bp的5’-末端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(5’-UTR),1131bp的ORF和494bp的3’-末端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’-UTR),共編碼376個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量38.43 k Da。Sp PPAF2序列c DNA全長為1808bp,其中包括88bp的5’-UTR,1125bp的ORF和595bp的3’-UTR,共編碼374個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量38.56 k Da。Sp PPAF1和Sp PPAF2都含有如下結(jié)構(gòu):信號肽區(qū)域、一個典型的N端clip結(jié)構(gòu)域和具有催化活性的C端絲氨酸蛋白結(jié)構(gòu)域。兩者氨基酸序列相似性為81.0%。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sp PPAF1和Sp PPAF2在7個組織(血液、肝胰腺、鰓、精巢、心臟、肌肉和卵巢)中均有表達(dá),其中Sp PPAF1在鰓、精巢和血液中表達(dá)量較高,Sp PPAF2主要在血液中表達(dá)。用副溶血弧菌感染處理大眼幼體,結(jié)果顯示Sp PPAF1和Sp PPAF2的表達(dá)量除了感染的前6 h變化趨勢有略微不同外,在接下來的6 h都顯著升高,至12h時達(dá)到最大值,隨后下降,至72 h時基本恢復(fù)正常水平。結(jié)果表明擬穴青蟹中PPAF可能與機(jī)體對外來病原的免疫防御作用密切相關(guān),作用周期大約為72 h。2、酚氧化酶原(pro PO)是一種含銅的保守酶,也是酚氧化酶原激活系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分和黑色素生成的關(guān)鍵酶。本文獲得了擬穴青蟹pro PO基因的c DNA全長,比對結(jié)果顯示它與其他物種的pro PO具有較高的同源性,經(jīng)綜合分析后確定命名為Sppro PO。該序列全長為2688bp,其中包括40bp的5’-UTR,2133bp的ORF和515bp的3’-UTR,共編碼710個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量約為81.5 k Da,等電點(diǎn)約為6.01。序列分析結(jié)果顯示Sppro PO含有三個串聯(lián)的血藍(lán)蛋白保守結(jié)構(gòu)域和兩個保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測了Sppro PO在擬穴青蟹不同組織中的表達(dá)差異情況,結(jié)果顯示Sppro PO在擬穴青蟹的7個不同組織中均有表達(dá),其中在血液和精巢中表達(dá)量較高,在心臟中的表達(dá)量最低。本實(shí)驗(yàn)為深入研究擬穴青蟹酚氧化酶原基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。3、血藍(lán)蛋白(Hc)是許多節(jié)肢動物和軟體動物中重要的呼吸蛋白,為動物的生存提供了重要的支撐。本文克隆到了擬穴青蟹中Hc1、Hc2、Hc3和Hc4四個基因的c DNA全長,比對結(jié)果顯示它與其他物種的Hc具有較高的同源性,綜合分析后分別命名為Sp Hc1、Sp Hc2、Sp Hc3和Sp Hc4,全長分別為2281 bp,2002 bp,2184 bp和2069 bp,分別編碼676,570,672和671個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量分別為76.8,65.0,76.3和76.4 k Da。序列分析結(jié)果顯示Sp Hc含有三個串聯(lián)的血藍(lán)蛋白保守結(jié)構(gòu)域和兩個保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)研究了血藍(lán)蛋白基因在擬穴青蟹各個不同組織,n炞從滋錤1-Z5期、大眼幼體M期以及仔蟹C1期等7個不同發(fā)育階段的時空表達(dá)差異。分析結(jié)果表明Sp Hc在各個組織中均有表達(dá),其中主要在肝胰腺、精巢和血液中表達(dá);另外,在不同的發(fā)育時期也均有表達(dá),其中在前6個發(fā)育時期時,Sp Hc3和Sp Hc4的表達(dá)量要顯著高于Sp Hc1和Sp Hc2,但到仔蟹期時Sp Hc3和Sp Hc4的表達(dá)量突然下降,低于Sp Hc1和Sp Hc2。副溶血弧菌感染試驗(yàn)結(jié)果表明:在感染后的前3 h內(nèi),Sp Hc的表達(dá)量明顯下降,在隨后的9 h逐漸上升,至12 h時達(dá)到最大值。研究結(jié)果說明血藍(lán)蛋白基因可能參與了擬穴青蟹的免疫抗菌過程,且四個血藍(lán)蛋白基因在擬穴青蟹不同發(fā)育時期可能發(fā)揮著不同的作用,Sp Hc3和Sp Hc4可能在青蟹浮游生活時期發(fā)揮主要作用,而Sp Hc1和Sp Hc2可能在其底棲及以后的生活中發(fā)揮主要作用。綜上所述,本研究共克隆得到了7個與擬穴青蟹酚氧化酶系統(tǒng)相關(guān)的基因的c DNA全長序列,并研究了他們在擬穴青蟹中不同模式下的表達(dá)差異情況。研究結(jié)果初步揭示了擬穴青蟹酚氧化酶系統(tǒng)及血藍(lán)蛋白的分子基礎(chǔ)以及應(yīng)對微生物感染的調(diào)控趨勢,為今后這些基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 甲殼動物酚氧化酶原激活系統(tǒng)簡圖[9]Fig. 1-1 Schematic view of crustacean prophenoloxidase activating system[9].2 酚氧化酶原激活系統(tǒng)關(guān)鍵基因的研究概況

圖 2-1 擬穴青蟹總 RNA 電泳圖trophoresis profiles of S. paramamo SpPPAF2 基因全長 cDNA 的接驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)獲得擬穴青蟹現(xiàn)它們與其他物種的 PPAF 具成員，經(jīng)綜合分析后分別命名據(jù)庫，GenBank 登錄號分別為 bp 的堿基組成，其中包括 52TR，共編碼376個氨基酸，預(yù)測核苷酸以及對應(yīng)的氨基酸序列基組成，其中包括 88bp 的 5編碼 374 個氨基酸，預(yù)測蛋白兩條序列都含有多聚腺苷酸過 SignalP 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，，兩此預(yù)測 SpPPAF1 成熟肽包含
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 嚴(yán)芳;章躍陵;羅活強(qiáng);胡忠;黃通旺;葉向群;;凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白酚氧化酶活性的研究[J];水產(chǎn)科學(xué);2008年01期

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1 嚴(yán)芳;甲殼動物血藍(lán)蛋白免疫學(xué)活性及其作用機(jī)制研究[D];汕頭大學(xué);2011年

本文編號：2663529