【摘要】：弧菌是一類(lèi)彎曲或直桿狀的革蘭氏陰性細(xì)菌,其中一些種類(lèi)可以引起養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病,甚至可以引起人的疾病導(dǎo)致死亡。致病性弧菌擁有多種毒力因子,胞外蛋白酶是主要組成成分,對(duì)弧菌的致病性具有重要作用。弧菌普遍對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素具有抗性,主要機(jī)制之一是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,降解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。本論文對(duì)鰻弧菌胞外蛋白酶Epp的PKD1結(jié)構(gòu)域和副溶血弧菌β-內(nèi)酰胺酶VPBL開(kāi)展了結(jié)構(gòu)與功能研究。胞外蛋白酶一般以酶原前體的形式表達(dá)出來(lái),然后經(jīng)過(guò)多步加工成熟。金屬蛋白酶EmpA是鰻弧菌的一種重要毒力因子,其成熟需要該酶成功的分泌和加工,而一種蛋白酶Epp被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)胞外的pro-EmpA加工為成熟的EmpA。Epp與霍亂弧菌金屬蛋白酶PrtV具有高度的相似性,全長(zhǎng)包含信號(hào)肽、N端結(jié)構(gòu)域、M6金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)PKD結(jié)構(gòu)域(分別命名為PKD1和PKD2)。PrtV的PKD1的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析,Ca~(2+)可以通過(guò)結(jié)合PKD1結(jié)構(gòu),控制PrtV酶原的結(jié)構(gòu)域連接區(qū)域靈活性來(lái)調(diào)節(jié)成熟過(guò)程。因此Epp也可能會(huì)通過(guò)PKD1結(jié)構(gòu)受Ca2+調(diào)控成熟,但是具體激活機(jī)制完全未知。由于Epp的M6金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域沒(méi)有獲得可溶性蛋白,因此本研究中我們只解析了鰻弧菌Epp蛋白酶的第一個(gè)PKD的結(jié)構(gòu)(Epp-PKD1)以及研究了它Ca~(2+)結(jié)合的特異性。Epp-PKD1在溶液中以單體形式存在,結(jié)構(gòu)主要是七個(gè)β-折疊構(gòu)成的兩個(gè)β-片層,每個(gè)蛋白分子的N3、Q4、D27、D29、D68和一個(gè)水分子與Ca~(2+)形成五角雙錐體的構(gòu)象。Ca~(2+)與apo Epp-PKD1孵育可以促進(jìn)蛋白的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,而Mg~(2+)、Mn~(2+)和Zn~(2+)都不可以,顯示Epp-PKD1結(jié)合Ca~(2+)具有特異性。盡管Epp-PKD1與PrtV-PKD1在序列和結(jié)構(gòu)上有高的同源性,但是兩者在多聚狀態(tài)和Ca~(2+)結(jié)合位點(diǎn)是不同的,說(shuō)明PrtV和Epp受Ca~(2+)調(diào)控成熟是不同的。我們的研究有助于更好地理解PKD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的Ca~(2+)調(diào)控蛋白酶的成熟過(guò)程。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是治療細(xì)菌感染使用最廣泛的抗生素,具有毒性小、成本低、抗菌活性廣、臨床療效好等優(yōu)點(diǎn)。然而,細(xì)菌會(huì)進(jìn)化出各種耐藥性機(jī)制,阻礙其應(yīng)用。染色體編碼的β-內(nèi)酰胺酶是副溶血弧菌抗β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的主要原因,在這里我們首次解析了副溶血弧菌的A類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶VPBL的晶體結(jié)構(gòu)。VPBL結(jié)構(gòu)由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,一個(gè)是α/β結(jié)構(gòu)域,包括5個(gè)反向平行的β折疊和3個(gè)α螺旋,另一個(gè)是主要由α螺旋組成的α結(jié)構(gòu)域�；钚晕稽c(diǎn)位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間,主要由四個(gè)保守序列_(70)STFK_(73)、_(130)SDN_(132)、_(166)ExxLN_(170)、_(234)KTG_(236)組成。與已知的A類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶相比,VPBL包含一個(gè)保守的活性位點(diǎn),但在遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的位置存在氨基酸的差異,這在一定程度上影響酶的催化活性。與其他β-內(nèi)酰胺酶和底物復(fù)合物的比較揭示了該酶對(duì)底物和抑制劑結(jié)合的偏好性,與酶活性相互印證。我們的結(jié)果支持了β-內(nèi)酰胺酶抑制劑可與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素結(jié)合共同用于治療副溶血弧菌感染的這種新策略。同時(shí)我們進(jìn)行定向進(jìn)化研究了該酶的可塑性,發(fā)現(xiàn)VPBL具有較好的可塑性,可以通過(guò)氨基酸替換形成對(duì)抑制劑的抗性,這些突變可以協(xié)同作用增加抑制劑的抗性。因此仔細(xì)監(jiān)測(cè)酶突變對(duì)于β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素組合治療感染是必要的。β-內(nèi)酰胺酶是該策略的關(guān)鍵,所以對(duì)β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)和可塑性的研究有助于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合在治療弧菌中的應(yīng)用。另一方面,這些結(jié)果也提供給我們結(jié)構(gòu)信息來(lái)設(shè)計(jì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和抑制劑治療弧菌感染。
【圖文】：

基因、四環(huán)素耐藥基因 (Charles andAnthony, 2017)。（V.anguillarum）屬于弧菌屬、弧菌科，端生鞭毛，非孢子氧(Madigan et al., 2000; Buller, 2004)(圖 1.1)。該菌在含有 1.培養(yǎng)基上，在 25-30℃的溫度下可以快速生長(zhǎng)，形成奶油色鰻弧菌分為兩種不同的生物類(lèi)型 (1 型和 2 型) (Harrell et al技術(shù)的進(jìn)步，鰻弧菌 2 型被重新歸類(lèi)為新物種 Vibrio ordalii。基于 5S rRNA 基因序列分析，鰻弧菌 1 型被重新分類(lèi)為 (MacDonell and Colwell, 1985)。然而，由于它與其他弧菌緊被稱(chēng)為 V. anguillarum (Wiik et al., 1995)。例如，鰻弧菌與溶和費(fèi)氏弧菌的 16SrRNA 基因顯示有超過(guò) 95%的相似性，這個(gè)屬的依據(jù) (Wiiket et al., 1995; Clarridge 2004)。

胞外的 pro-EmpA 加工成熟為 EmpA�；� epp 編碼了一種 918 個(gè)氨基酸的酶，與先前報(bào)道的 V. cholerae 金屬蛋白酶 PrtV 和其他假定蛋白酶具有高度似性（如表 1.3）。PrtV 的成熟是由 Ca2+調(diào)控的 (Aaronetal.,2014)，，PrtV 的白酶原包含信號(hào)肽、N 端結(jié)構(gòu)域、M6 金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域和兩個(gè) PKD 結(jié)構(gòu)別命名為 PKD1 和 PKD2)（如圖 1.2）。PrtV 全長(zhǎng) 102 kDa，分泌到胞外時(shí)信號(hào)肽和 PKD2 結(jié)構(gòu)域形成 81 kDa 的形式，Ca2+調(diào)節(jié)蛋白水解形成 55kD性復(fù)合物，包含兩個(gè) 18 kDa 和 37 kDa 的蛋白鏈。PrtV 中 PKD 結(jié)構(gòu)域的功不完全清楚，但 PrtV 的成熟需要除去兩個(gè) PKD 結(jié)構(gòu)域。PKD1 的結(jié)構(gòu)已經(jīng)析，Ca2+可以通過(guò)結(jié)合 PKD1 結(jié)構(gòu)，控制 PrtV 酶原的結(jié)構(gòu)域連接區(qū)域靈活調(diào)節(jié)成熟過(guò)程 (Aaron et al., 2013)。PKD1 失去 Ca2+后與金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域區(qū)域的柔韌性增加從而斷裂，使 PrtV 的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)進(jìn)一步降解成熟，然而 PKD1 結(jié)構(gòu)域的功能仍然不是很清楚，需要進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S941.42

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1 李培海;弧菌金屬蛋白酶Epp和β-內(nèi)酰胺酶VPBL的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所);2018年

本文編號(hào)：2655832