【摘要】：轉(zhuǎn)座子(transposon)是一類可以在基因組中改變插入位置的遺傳因子,能夠通過水平轉(zhuǎn)移(horizontal transfer)的方式在自然界的不同物種間擴(kuò)散傳播。轉(zhuǎn)座子所編碼的活性轉(zhuǎn)座酶能夠啟動(dòng)其在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)座過程,然而脊椎動(dòng)物中的一些轉(zhuǎn)座子由于突變等原因大多數(shù)均已失去活性,成為了非自主性轉(zhuǎn)座子,從而不能完成整個(gè)轉(zhuǎn)座過程。2008年,在不同的金魚品系中通過篩選,最終獲得金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子,它是繼第一類具有自主轉(zhuǎn)座活性的青溕Tol2之后的第二類具有自主轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子,屬于hAT(hobo-AC-Tam)超家族。Tgf2轉(zhuǎn)座子能夠編碼完整、具有自主轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座酶,在魚類轉(zhuǎn)基因、基因捕獲等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室從金魚胚胎中分離得到了7種不同的Tgf2轉(zhuǎn)座子mRNA轉(zhuǎn)錄本,同時(shí)得到了三種氨基酸長度分別為686、650和577的Tgf2轉(zhuǎn)座酶。目前這三種長度的轉(zhuǎn)座酶均已在E.coli中表達(dá),為了進(jìn)一步提高表達(dá)量及其表達(dá)穩(wěn)定性,依據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏好性和簡(jiǎn)并性對(duì)686長度的轉(zhuǎn)座酶密碼子進(jìn)行了優(yōu)化。本研究目的則是利用pET28a(+)作為質(zhì)粒載體,E.coli BL21(DE3)作為宿主菌,表達(dá)出密碼子優(yōu)化后的686長度Tgf2轉(zhuǎn)座酶,并研究能夠保存純化后的轉(zhuǎn)座酶穩(wěn)定性的方法。同時(shí)用含有不同重復(fù)序列數(shù)目的探針研究其DNA結(jié)合活性及特異性,從而為構(gòu)建具有更高活性的轉(zhuǎn)座酶提供幫助。本實(shí)驗(yàn)主要分為四個(gè)部分。第一部分為重組表達(dá)載體的構(gòu)建,首先依據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的簡(jiǎn)并性和偏好性對(duì)金魚Tgf2轉(zhuǎn)座酶的密碼子進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后的Tgf2轉(zhuǎn)座酶命名為Tgf2-TPase~(83)。用限制性內(nèi)切酶Bam I和XholI分別對(duì)含有Tgf2-TPase~(83)基因序列的克隆載體和表達(dá)載體pET28a(+)雙酶切,用T_4 DNA連接酶將它們連接起來。根據(jù)轉(zhuǎn)座酶和載體的特點(diǎn)設(shè)計(jì)合適的引物,PCR檢測(cè),用基因測(cè)序方法鑒定連接后的序列,序列對(duì)比結(jié)果表明,重組表達(dá)載體pET28a(+)-Tgf2-TPase~(83)構(gòu)建成功。第二部分為重組載體pET28a(+)-Tgf2-TPase~(83)的原核表達(dá)、純化和質(zhì)譜鑒定。本實(shí)驗(yàn)中選擇BL21(DE3)作為表達(dá)的宿主菌,使得重組載體質(zhì)粒在BL21(DE3)中表達(dá),表達(dá)條件為溫度30℃、IPTG濃度1.0 mM、誘導(dǎo)時(shí)間6 h、轉(zhuǎn)速150 rpm,用SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在蛋白分子量大約為79.6 kDa處不但有相應(yīng)的條帶出現(xiàn),而且表達(dá)后此處的蛋白條帶有明顯加深,所以目的蛋白表達(dá)成功。在SDS-PAGE中可以表達(dá)出可溶性蛋白,故我們采用反復(fù)凍融、超聲破碎、離心取上清的方法用His Trap~(TM) HP柱子對(duì)重組蛋白純化,分別用20 mM、40 mM、500 mM的咪唑?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行洗脫,將最終收集的純化樣品用SDS-PAGE分析,割膠并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明,密碼子優(yōu)化后的Tgf2-TPase~(83)表達(dá)量提高到了6.3%,純度提高到了85%。同時(shí),質(zhì)譜結(jié)果表明,重組蛋白Tgf2-TPase~(83)即為金魚Tgf2轉(zhuǎn)座酶。第三部分為重組蛋白Tgf2-TPase~(83)的保存穩(wěn)定性研究。本實(shí)驗(yàn)中選取了四種不同的保存方法,分別為:加入20%甘油、直接凍干、加入凍干保護(hù)劑8%蔗糖和4%甘露醇后冷凍干燥,均置于-80℃中進(jìn)行保存。用質(zhì)粒pTgf2-EF1α-EGFP檢測(cè)分別保存7 d和14 d后Tgf2-TPase~(83)的DNase活性,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),通過BandScan掃描,將質(zhì)粒的變化情況進(jìn)行量化處理,得到不同的消化速度。結(jié)果表明,以新鮮酶液的DNase活性作為對(duì)照,20%甘油有助于保存Tgf2-TPase~(83)酶活性,其他三種保存方法都沒有20%甘油的保存效果好。第四部分為重組蛋白Tgf2-TPase~(83)的DNA結(jié)合活性及其特異性研究。首先,對(duì)用20%甘油保存的Tgf2-TPase~(83)酶進(jìn)行DNA結(jié)合活性研究;其次,金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列包括5’AGTAA3’和5’GTACT3’,我們從Tgf2轉(zhuǎn)座子左臂末端設(shè)計(jì)了四種含有不同重復(fù)序列數(shù)目的探針,分別為P_H,P_(M1),P_(M2),P_L,其中探針P_L中包含有與原始重復(fù)序列不同的堿基為5’GGTAA3’。實(shí)驗(yàn)中我們用葡聚糖凝膠層析來判斷Tgf2-TPase~(83)是否具有DNA結(jié)合活性,主要是根據(jù)蛋白與探針結(jié)合后的紫外吸收值是否有增加。同時(shí),用蛋清溶菌酶作為陰性對(duì)照,判斷Tgf2-TPase~(83)的DNA結(jié)合活性是否具有特異性。結(jié)果表明,用20%甘油保存7 d、14 d、30 d時(shí)的Tgf2-TPase~(83)酶是具有DNA結(jié)合活性的;含有不同重復(fù)序列數(shù)目的探針與重組蛋白Tgf2-TPase~(83)的DNA結(jié)合活性是不同的,重復(fù)序列數(shù)目越多,其結(jié)合活性越高。另外,陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Tgf2-TPase~(83)的DNA結(jié)合活性是具有特異性的。通過密碼子優(yōu)化后的Tgf2轉(zhuǎn)座酶不僅增加了其表達(dá)量(6.3%),而且純化后其純度(85%)也得到了提高。采用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的可溶性重組蛋白Tgf2-TPase~(83)不僅為魚類轉(zhuǎn)基因提供了更加有效的手段,而且也促進(jìn)了轉(zhuǎn)座子基因捕獲、基因捕獲和魚類遺傳育種等方面的應(yīng)用。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文時(shí)出現(xiàn)差異，即為密碼子偏愛性。同時(shí)，也存在著一定的簡(jiǎn)并性。從 19 中不同魚類物種和品系中篩選出來金魚 Tgf2 轉(zhuǎn)座子，其轉(zhuǎn)座酶（Tgf2-TPase）中含有一些稀有密碼子，使大腸桿菌難以識(shí)別，如 AGA，UCG，AGG 等。我們使用稀有密碼子分析工具（GeneScript Rare Codon Analysis Tool）可知：Tgf2-TPase 的密碼子使用頻率分布系數(shù)（Codon Frequency Distribution,CFD），GC 含量和密碼子適應(yīng)指數(shù)（CodonAdaption Index,CAI）分別為：1%，51.28%和 0.83。參考大腸桿菌對(duì)密碼子的兩種特性，我們對(duì) Tgf2-TPase 包含的稀有密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，如圖 1-1 所示，使得 CFD，CAI 和 GC 同時(shí)達(dá)到了理想?yún)^(qū)間指標(biāo)。Tgf2-TPase 轉(zhuǎn)座酶包括 686個(gè)氨基酸，長度為 2061 bp，密碼子共優(yōu)化 83 處，19 種不同的氨基酸。

圖 1-2 Tgf2-TPase83的雙酶切電泳檢測(cè)A 標(biāo)準(zhǔn)分子量 marker；1：Tgf2-TPase83的雙 1-2 Double enzyme cutting detection of Tgf2-TP marker; 1: Double enzyme cutting product of Tg得本身含有的 XhoI 與 BamHI 酶切位點(diǎn)，用目的片段大小為 5369 bp。檢測(cè)電泳如行割膠回收。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78;S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄒曙明;杜雪地;袁劍;蔣霞云;;金魚hAT家族轉(zhuǎn)座子Tgf2的克隆及其結(jié)構(gòu)[J];遺傳;2010年12期

2 孫東坡,胡一橋;蛋白質(zhì)冷凍干燥制品中的保護(hù)劑及其保護(hù)機(jī)制[J];藥學(xué)進(jìn)展;2003年04期

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本文編號(hào)：2652764