【摘要】：對(duì)生活在極端寒冷下的魚(yú)類(lèi)而言,如何避免受到寒冷環(huán)境的傷害是一個(gè)極其重要的問(wèn)題。南極Notothenioids魚(yú)類(lèi)之所以能在南極極端寒冷的環(huán)境下生存,并成為南極海域主要的魚(yú)類(lèi)物種,是因?yàn)槠涑婶~(yú)體內(nèi)含有高濃度的抗凍糖蛋白(AFGPs),但是在南極Notothenioids魚(yú)類(lèi)的魚(yú)卵和幼魚(yú)體內(nèi)AFGPs的表達(dá)水平非常低,甚至沒(méi)有表達(dá),南極Notothenioids魚(yú)類(lèi)的魚(yú)卵和幼魚(yú)是怎樣避免寒冷傷害還未可知。Zona pellucida(ZP)蛋白基因家族編碼一類(lèi)參與識(shí)別精卵的卵殼蛋白,已有研究發(fā)現(xiàn)在南極Notothenioids魚(yú)類(lèi)中許多類(lèi)型的ZP基因發(fā)生了特異性的大規(guī)模擴(kuò)增。本研究發(fā)現(xiàn)南極魚(yú)ZP蛋白具有冰晶結(jié)合活性,并修飾冰晶生長(zhǎng)的形態(tài),使含南極魚(yú)ZP蛋白溶液的冰晶呈規(guī)則的六棱柱形狀,并且使該溶液的熔點(diǎn)降低,促進(jìn)冰晶的溶化。所以南極魚(yú)ZPs是一類(lèi)冷脅迫相關(guān)蛋白,能與AFPs共同作用,使南極魚(yú)類(lèi)在-1.9℃的寒冷環(huán)境下生存,并避免冰晶對(duì)南極魚(yú)魚(yú)體的機(jī)械傷害。ZP蛋白具有的冰晶結(jié)合活性是一種固有的原始功能,還是只是在南極Notothenioids魚(yú)類(lèi)ZP蛋白所特有的功能呢?所以我們選擇了與南極魚(yú)生活環(huán)境相似的齊口裂腹魚(yú)(Schizothorax prenanti,SP)的ZP蛋白(SP_ZP3)進(jìn)行研究,齊口裂腹魚(yú)也是一種寒冷環(huán)境下生活的物種,其分布水域的特點(diǎn)是海拔高、氣溫低。研究發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚(yú)的ZP蛋白具有弱的冰晶結(jié)合活性,但不能降低溶液的冰點(diǎn)。本研究主要通過(guò)RT-PCR的方法,從南極Notothenioids魚(yú)類(lèi)和齊口裂腹魚(yú)卵巢的總RNA中克隆得到多種zona penucida基因的編碼區(qū),并構(gòu)建這些基因的真核表達(dá)載體,然后在中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢細(xì)胞(CHO-K1)中進(jìn)行表達(dá),并用分離純化得到的ZP蛋白進(jìn)行冰晶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZP蛋白溶液的冰晶形狀呈規(guī)則六棱柱,證明ZP蛋白能與冰晶進(jìn)行結(jié)合,并改變了冰晶的生長(zhǎng)形態(tài),具有冰晶結(jié)合活性。ZP蛋白是包含ZP結(jié)構(gòu)域的一類(lèi)蛋白,存在于所有的脊椎動(dòng)物中。該蛋白基因鐫刻著進(jìn)化的歷史,ZP基因無(wú)論是在低等生物(如線蟲(chóng))還是在高等哺乳動(dòng)物中都有分布,該基因在魚(yú)類(lèi)中被稱為卵殼蛋白基因,在高等哺乳動(dòng)物中被叫作透明帶蛋白基因。ZP蛋白作為卵細(xì)胞外膜的重要組成部分參與了的受精過(guò)程,研究表明,參與該過(guò)程的基因進(jìn)化速度要比其他基因快。南極Notothenioids魚(yú)類(lèi)的ZP基因在寒冷條件下大量擴(kuò)增,是南極魚(yú)適應(yīng)南極極端寒冷環(huán)境的重要機(jī)制,ZP基因的擴(kuò)增又加快了ZP基因的進(jìn)化,使其進(jìn)化成為一類(lèi)冷脅迫蛋白,使南極魚(yú)類(lèi)適應(yīng)極端寒冷的水環(huán)境。而本研究顯示SP_ZP3蛋白有冰晶結(jié)合活性,這種活性可能是生活在寒冷環(huán)境下魚(yú)類(lèi)ZP蛋白的一種原始功能,而在南極Notothenioids魚(yú)類(lèi)中,這種功能在高強(qiáng)度的寒冷壓力下會(huì)被持續(xù)放大,獲得了明顯降低熔點(diǎn)的功能。
【圖文】：

受態(tài)細(xì)胞：大腸桿菌 XL10-Gold，DH-5α；養(yǎng)細(xì)胞系：CHO-K1 細(xì)胞系，ATCC Number: CCL-61 ；表 2.2.3 實(shí)驗(yàn)所用的南極魚(yú)類(lèi)樣品及采集的位置Species Family Locality （latitude, longitude）raco hamatus Channichthyidae Pryz Bay （68°36′S, 78.0°E）tichus mawsoni Nototheniidae McMurdo Sound, Ross Sea（77°51.0′S ,166°4draco acuticeps Bathydraconidae Zhongshan Station, Antarctica（69°22.0′S,76°2實(shí)驗(yàn)的方法和步驟Zona pellucida 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 pIRES2-EGFP 載體的示意圖

圖 2.1.1-1 齊口裂腹魚(yú)卵巢總 RNA 的電泳和 SP_ZP3 的克隆（a. 卵巢總 RNA 的電泳檢測(cè)；b. SP-ZP3 基因的 RT-PCR 結(jié)果；c. 用 M13 引物對(duì) T-SP_ZP3 載體的菌落 PCR 驗(yàn)證）ig 2.1.1-1 Electrophoresis of total RNA of Schizothorax prenanti and cloning of SP_Z對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該基因所編碼的蛋白質(zhì)分子055，其等電點(diǎn) pI 的理論值為 8.63。通過(guò) SMART 軟件預(yù)測(cè)，該蛋白質(zhì)基酸到 31 個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，，第 133 aa 至 384 aa 之間有個(gè)保守的--透明帶結(jié)構(gòu)域（Zona pellucida domain），第 430 aa 到 444 aa 之間為域（表圖 3.1.1-2）。根據(jù) SP-ZP3 基因的序列，從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其種的氨基酸同源序列，使用 MEGA 5.1 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果（，Zona pellucida 3 基因在魚(yú)類(lèi)中較為保守，齊口裂腹魚(yú)（Schizothorax pr他魚(yú)類(lèi)（鯽魚(yú) Carassius auratus，鯉魚(yú) Cyprinus carpio，黑頭軟口鰷 Pimelas，翹嘴湆 Culter alburnus，稀有泩?chǎng)a Gobiocypris rarus，斑馬魚(yú) Danio緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 武云飛;陳宜瑜;;西藏北部新第三紀(jì)的鯉科魚(yú)類(lèi)化石[J];古脊椎動(dòng)物與古人類(lèi);1980年01期

2 李吉均,文世宣,張青松,王富葆,鄭本興,李炳元;青藏高原隆起的時(shí)代、幅度和形式的探討[J];中國(guó)科學(xué);1979年06期

本文編號(hào)：2651835