【摘要】：紫菜是我國海藻產(chǎn)業(yè)的重要組成部分,隨著栽培產(chǎn)量和密度的增加,紫菜病害發(fā)生嚴重,成為重影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。我國紫菜病害研究起步較晚、基礎(chǔ)薄弱,病害種類和病原種類不清楚,病害發(fā)生機制不明,病害防控手段缺乏,各方面的工作亟待開展。本文初步調(diào)查了條斑紫菜(Pyropia yezoensis)苗期和栽培期的病害,分離鑒定了苗期貝殼絲狀體的可培養(yǎng)微生物,進一步分析了貝殼絲狀體黃斑病的發(fā)病過程和病原種類;建立了一種紫菜綠斑病病原的PCR檢測方法。本論文研究結(jié)果將為我國紫菜流行病學研究提供數(shù)據(jù)和支撐。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.條斑紫菜苗期和栽培期的病害調(diào)查。從2017年8月至2019年1月,對江蘇、浙江、山東的十多個養(yǎng)殖場開展病害調(diào)查。育苗期間,多數(shù)育苗場都不同程度發(fā)生病害,出現(xiàn)黃斑、白斑、鯊皮等病征,以黃斑病最常見,其次為白斑病,有的養(yǎng)殖池同時發(fā)生兩種病,發(fā)病嚴重的可導(dǎo)致整個養(yǎng)殖場絕收。發(fā)病和未發(fā)病育苗池的水質(zhì)理化指標未見顯著性差異。栽培期間,赤腐病、擬油壺菌病最常見。在兩個發(fā)病海區(qū)鑒定了兩種卵菌病原,分別為腐霉Pythium chondricola、擬油壺菌Olpidiopsis pyropia。2.紫菜育苗期可培養(yǎng)微生物的分析。對2017年9月及2018年10月采集的黃斑病及未發(fā)病的育苗池水和貝殼絲狀體可培養(yǎng)微生物進行分離鑒定,共分離得到79屬細菌571株,5屬放線菌8株,未分離到真菌�？膳囵B(yǎng)微生物豐度依次為:變形菌門Proteobacteria(81.28%)、擬桿菌門Bacteroidetes(10.25%)、厚壁菌門Firmicutes(6.55%)、放線菌門Actinobacteria(1.92%)。比較患黃斑病和未發(fā)病樣品的細菌種類,發(fā)現(xiàn)患病樣品分離到的弧菌科(Vibrionaceae)、紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)、鹽單胞菌科(Halomonadaceae)、假交替單胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)的細菌明顯多于未發(fā)病樣品,未發(fā)病樣品的紅螺菌科(Rhodospirillaceae)和赤桿菌科(Erythrobacteraceae)的細菌明顯多于發(fā)病樣品。對上述菌株的胞外酶產(chǎn)生情況進行分析,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生酪蛋白酶、明膠酶、淀粉酶、脂肪酶、瓊膠酶的有319株、377株、288株、35株、5株,未見有產(chǎn)果膠酶和纖維素酶的菌株。發(fā)現(xiàn)從患黃斑病樣品分離得到的菌株多數(shù)產(chǎn)生酪蛋白酶、淀粉酶、明膠酶和瓊膠酶酶活。3.條斑紫菜絲狀體貝殼溶殼條件的篩選。生產(chǎn)上常用溶殼劑溶解紫菜貝殼絲狀體來獲取絲狀體,用以觀察紫絲狀體的生長和發(fā)育情況。為了減少溶殼劑作用強度對絲狀體的影響,本研究比較了柏蘭尼液和醋酸(7%、10%、15%和20%)兩種溶殼劑在不同作用濃度和不同作用時間的溶殼效果、對絲狀體形態(tài)變化和損傷的影響。結(jié)果顯示,柏蘭尼液的溶殼效果最好,其作用時間為90 s時,對絲狀體形態(tài)變化和損傷影響最輕。4.條斑紫菜貝殼絲狀體黃斑病的病程觀察和可疑病原的確定。將患病貝殼絲狀與正常條斑紫菜貝殼絲狀體共同培養(yǎng),7天后可觀察到正常貝殼出現(xiàn)零星幾個針尖大小的黃色斑點,隨著感染時間增加,黃色斑點數(shù)量逐漸增加、直徑逐漸增大,一般在5-7周病斑出現(xiàn)爆發(fā)式增加,病斑可漸漸增大至2mm左右。在顯微鏡下觀察,發(fā)病絲狀體經(jīng)歷棕紅色、橙色、黃色的變化,最后藻絲崩解、內(nèi)容物消失。從患黃斑病樣品分離得到的菌株中選擇17株,回接感染條斑紫菜貝殼絲狀體和自由絲狀體,有5株菌菌株(Ruegeria,Roseovarius,Marinomonas,Maribacter,Flavobacterium)能引起絲狀體出現(xiàn)黃斑的癥狀。5.條斑紫菜綠斑病病原PCR檢測方法的建立。針對條斑紫菜綠斑病病原假交替單胞菌Pseudoalteromonas tbzcY1的dnaA和dnaN基因,選擇保守區(qū)設(shè)計2對簡并引物pw-dnaA和pw-dnaN1,擴增片段分別為1258和1054 bp,通過16S rRNA、dnaA和dnaN基因序列的進化分析比較,確定tbzcY1屬于海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas marina)。選擇高變區(qū)設(shè)計3對特異引物pws-dnaA2、pcs-dnaN2、pws-dnaN13,擴增片段分別為386、253、721 bp,進行特異性和靈敏性試驗。結(jié)果表明這3對引物均能特異性從22種其他海水細菌中檢測到P.marina,其中pws-dnaA2靈敏度最高,檢測下限為每反應(yīng)4 CFU細菌或23.7 fg細菌基因組DNA。P.marina人工侵染條斑紫菜引起綠斑病顯微癥狀后,3對引物均能檢出該病原。上述結(jié)果表明該方法可用于檢測由P.marina引起的條斑紫菜綠斑病。
【圖文】：

紫菜生活史a為有性生殖階段；b為無性生殖階段[40]

圖 2-1 紫菜病害調(diào)查地點及日期Fig. 2-1 Investigation region and date of Pyropia disease指標測定
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S946.2

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本文編號：2614560