發(fā)布時間：2020-04-02 07:37

【摘要】：羅非魚是一種在全世界廣泛養(yǎng)殖的經濟魚類,近年來,以鏈球菌病為代表的羅非魚病害頻繁發(fā)生,給羅非魚產業(yè)造成了巨大的經濟損失,嚴重阻礙了該產業(yè)的健康發(fā)展。由于其較高的經濟價值,對羅非魚病害的研究逐漸成為水產動物病害防治領域的研究熱點,而由無乳鏈球菌引起的鏈球菌病是其中一個主要的研究方向。然而,目前關于羅非魚的T細胞,特別是關于T細胞激活方面的研究還十分有限。CD59、CD2BP2和Lck是三種與共刺激分子CD2存在互作的關鍵蛋白分子,在CD2介導的T細胞激活中起到著至關重要的作用。為了解羅非魚T細胞對胞內寄生菌的免疫應答機制,本研究以尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)為研究對象,克隆了尼羅羅非魚CD59、CD2BP2和Lck的cDNA序列全長,并對其組織分布、對無乳鏈球菌刺激的免疫應答以及功能特征進行了初步的研究。CD59是一種重要的補體抑制蛋白和T細胞調節(jié)蛋白,在非特異性免疫應答和特異性免疫應答中都發(fā)揮著重要的作用。在本研究中,尼羅羅非魚的CD59基因(簡稱為On-CD59)被成功克隆,序列分析結果表明On-CD59的cDNA全長為1176 bp,包含一段長為74 bp的5'端非編碼區(qū)、一段長為748 bp的3'端非編碼區(qū)以及一段長為354 bp、編碼117個氨基酸的開放式閱讀框(ORF)。On-CD59所推測的氨基酸序列具有已知CD59分子所具有的五大特征結構,包括N端的信號肽、C端的GPI錨定區(qū)、中間的LU結構域、CCXXXXCN基序以及10個半胱氨酸殘基。在健康的羅非魚中,On-CD59 mRNA的表達在本研究所檢測的所有組織中都能被檢測到,其中在腦的表達量遠高于其他組織;在經滅活無乳鏈球菌刺激24 h后,On-CD59 mRNA在皮膚、大腦、頭腎、胸腺和脾臟的表達都發(fā)生了顯著的上調。此外,在滅活無乳鏈球菌刺激后,On-CD59的表達在皮膚、腦、頭腎、胸腺和脾臟表現出明顯的時間依賴性表達模式,On-CD59在皮膚的表達水平于免疫12 h后達到峰值,而在腦和頭腎則是于免疫24 h后達到峰值,在胸腺和脾臟到達峰值的時間最晚,為免疫48 h后。補體抑制活性試驗結果表明On-CD59不但具有補體抑制活性,而且這種活性具有物種選擇性。而生物素-鏈霉親和素ELISA以及集落形成單位試驗結果則分別表明,On-CD59能結合革蘭氏陽性菌細胞壁的主要組分PGN和LTA,并對無乳鏈球菌具有一定的抗菌活性。CD2BP2是幾種與CD2胞質區(qū)結合的接頭蛋白之一,在CD2介導的T細胞激活以及核剪接中都起著關鍵的作用。在本研究中,尼羅羅非魚的CD2BP2基因(簡稱為On-CD2BP2)被成功克隆,序列分析結果表明On-CD2BP2的cDNA全長為1429 bp,包含一段長為111 bp的5'端非編碼區(qū)、一段長為193 bp的3'端非編碼區(qū)以及一段長為1125 bp、編碼374個氨基酸的開放式閱讀框。On-CD2BP2所推測的氨基酸序列具有已知CD2BP2分子所具有的兩大特征結構,即C端的GYF結構域和GPFXXXXMXXWXXXGYF基序,且其所推測的基因結構與已知的CD2BP2分子十分相似。在健康的羅非魚中,On-CD2BP2 mRNA在頭腎、脾臟和肝臟的表達量較高;在經滅活無乳鏈球菌刺激48 h后,On-CD2BP2 mRNA在頭腎、脾臟和腦的表達都發(fā)生了顯著的上調。此外,在滅活無乳鏈球菌刺激后,On-CD2BP2在頭腎、脾臟和腦的表達表現出明顯的時間依賴性表達模式。On-CD2BP2在腦的表達水平于免疫24 h后達到峰值,而在頭腎和脾臟則是于免疫48 h后達到峰值。Lck在關于T細胞的分化、增殖和效應功能的信號轉導中都起著至關重要的作用。在本研究中,尼羅羅非魚的Lck基因(簡稱為On-Lck)被成功克隆,序列分析結果表明On-Lck的cDNA全長為2213 bp,包含一段長為286 bp的5'端非編碼區(qū)、一段長為421 bp的3'端非編碼區(qū)以及一段長為1506 bp、編碼501個氨基酸的開放式閱讀框。On-Lck所推測的氨基酸序列具有對于轉導TCRs信號所不可缺少的幾個結構特征,且其所推測的基因結構與已知的Lck分子十分相似。在健康的羅非魚中,On-Lck mRNA在胸腺、脾臟、頭腎和鰓的表達量較高;在經滅活無乳鏈球菌刺激后,On-Lck mRNA在胸腺、脾臟和頭腎的表達都發(fā)生了顯著的上調。此外,在滅活無乳鏈球菌刺激后,On-Lck在頭腎、脾臟和腦的表達表現出明顯的時間依賴性表達模式。On-Lck在胸腺和脾臟的表達水平于免疫48 h后達到峰值,而在頭腎則是于免疫72 h后達到峰值。
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 文雅;陶妍;;尼羅羅非魚Hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達及其抗菌活性[J];上海交通大學學報(農業(yè)科學版);2012年04期

2 王培;魯義善;王蓓;湯菊芬;蔡佳;吳灶和;簡紀常;;無乳鏈球菌誘導吉富羅非魚分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重鏈基因的克隆及原核表達[J];生物技術通報;2014年02期

相關碩士學位論文 前1條

1 張雪利;紅笛鯛重組激活基因克隆及表達分析[D];廣東海洋大學;2012年

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本文編號：2611659