發(fā)布時間：2020-04-01 22:12

【摘要】：紅細胞,特別是低等脊椎動物紅細胞,除了能夠完成氣體運輸外,可能在免疫、代謝中發(fā)揮重要功能。本文以尼羅羅非魚為動物模型,觀察尼羅羅非魚紅細胞和白細胞的形態(tài)及成熟紅細胞胞質(zhì)內(nèi)細胞器的分布,檢測羅非魚紅細胞中基因的表達情況。實驗挑選平均體重在200±10g的尼羅羅非魚,借助Ficoll離心法分離紅細胞及白細胞,使用吉姆薩-瑞氏染色法及熒光染色法分別對羅非魚紅細胞和白細胞進行染色,并通過顯微鏡觀察和計數(shù)。羅非魚全血中紅細胞占多數(shù),紅細胞形狀為橢圓形,有一個近圓形的細胞核,位于細胞的中央。而白細胞數(shù)量較少,且形狀不規(guī)則。純化后的白細胞形態(tài)不一,由多種細胞構(gòu)成。使用細胞分離液的分離效果較好,紅細胞的比例高于99%,而白細胞的比例則大于95%。使用熒光染料處理羅非魚紅細胞以觀察活體細胞器(溶酶體和線粒體),結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在細胞質(zhì)中分布均勻。結(jié)果表明,羅非魚成熟紅細胞仍然具有細胞核和一些類型的細胞器,細胞結(jié)構(gòu)相對完整。而這些完整的細胞結(jié)構(gòu),使得羅非魚紅細胞有可能具有轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白質(zhì)等細胞生物學功能。完成紅白細胞分離后,借助高通量測序技術(shù),對羅非魚紅細胞和白細胞的轉(zhuǎn)錄組進行測定及生物信息學分析。測序得到的原始數(shù)據(jù)通過篩選后分別得到4.24G和4.18G數(shù)據(jù)量。兩端測序的總reads數(shù)均為14149487。樣品的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估為:白細胞clean data的Q20達到96.04%,而Q30為88.54%;紅細胞clean data的Q20達到97.72%,而Q30為90.63%。白細胞和紅細胞轉(zhuǎn)錄組GO注釋后,發(fā)現(xiàn)兩種樣本的注釋結(jié)果相似程度較高。結(jié)果顯示,注釋到“molecular function”的次數(shù)最多(10,198,57.50%),其次是“bilogical process”和“cellular component”。將紅細胞和白細胞轉(zhuǎn)錄組預測基因比對到KOG數(shù)據(jù)庫進行分析。結(jié)果顯示,共有14260個預測蛋白成功注釋上KOG數(shù)據(jù)庫。19,762個基因成功注釋到COG數(shù)據(jù)庫。聚類到“signal transduction mechanisms”中的基因數(shù)量與注釋到其他條目的基因數(shù)量相比最多,共2427個;接著是“general function prediction only”和“transcription”,分別注釋了1184和1036個基因;聚類到“defense mechanisms”的基因共有134個。將兩種細胞的轉(zhuǎn)錄組進行差異分析后結(jié)果顯示,共有20,876個基因檢測到表達。其中,兩種細胞中共同表達的基因有16,231個。在白細胞中特異表達的基因共有3,628個,而在紅細胞中特異性表達的有1,017個基因。我們通過對兩種細胞中共同表達的基因進行顯著性差異分析,發(fā)現(xiàn)其中有3,251個基因存在顯著差異。其中,707(21.75%)個基因在紅細胞中的表達量顯著高于在白細胞中的表達量,而2544(78.25%)個基因在紅細胞中的表達量顯著低于在白細胞中的表達量。對羅非魚轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn),羅非魚紅細胞轉(zhuǎn)錄組中含有大量免疫基因,包括模式識別受體、補體成分、炎癥因子和受體、抗原提呈和處理分子、接頭、效應因子和信號傳導因子等幾大類。同時,羅非魚紅細胞轉(zhuǎn)錄組的KEGG注釋結(jié)果表明,羅非魚紅細胞包含了多種先天性免疫系統(tǒng)相關的信號通路,如Toll樣受體信號通路、RIG-I樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路等。使用qPCR試驗檢測經(jīng)poly(I:C)刺激24小時后的羅非魚紅細胞和白細胞。結(jié)果顯示,白細胞免疫基因的擴增結(jié)果表明,7種免疫基因表達量均在poly(I:C)注射處理后出現(xiàn)上調(diào)。其中irf3和irf9為顯著上調(diào),而irf1、irf2、irf4、irf5和tlr3為極顯著上調(diào)。對于羅非魚紅細胞,有5種免疫基因在處理后出現(xiàn)上調(diào)。其中,irf1和irf9為顯著上調(diào),而irf3、irf4和tlr3為極顯著上調(diào)。而irf2未出現(xiàn)顯著性變化。而irf5刺激后的表達量低于刺激前的表達量,但沒有顯著性。尼羅羅非魚干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)的表達量在IRF家族中最高,實驗克隆了尼羅羅非魚IRF1基因cDNA全長,與其它脊椎動物IRF1基因進行比對,構(gòu)建IRF家族系統(tǒng)進化樹。然后使用polyI:C對尼羅羅非魚進行體內(nèi)注射誘導抗病毒免疫反應,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測處理組和對照組中尼羅羅非魚各組織IRF1基因的表達差異。最后構(gòu)建尼羅羅非魚IRF1基因真核表達載體,對其進行細胞定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),尼羅羅非魚IRF1有888bp的開放讀碼框,能把編碼295個氨基酸的蛋白序列。該蛋白N端高度保守,并含有6個保守的色氨酸,具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對蛋白相似率的計算發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚與斑馬魚IRF1相似度為52.1%。而與大鼠IRF1的相似率最低,為36.2%。IRF家族成員蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示,IRF家族共分為四個亞群。將pCMV3-FLAG-IRF1真核表達載體轉(zhuǎn)染到Hela細胞中后,對IRF1基因進行核定位發(fā)現(xiàn),尼羅羅非魚IRF1主要分布在細胞質(zhì)中,細胞核中有少量分布。定量PCR檢測到各個組織中IRF1在不同暴露時間下的表達水平有顯著差異。
【圖文】：

果 羅非魚血細胞形態(tài)學觀察染色結(jié)束后，使用顯微鏡觀察染色結(jié)果。如圖 1-1 所示，通過對羅非魚外周循統(tǒng)中全血及分離后的紅、白細胞分別進行吉姆薩-瑞氏染色，觀察到羅非魚全視野下紅細胞占多數(shù)，而白細胞數(shù)量較少，且形狀不規(guī)則(1-1A)。羅非魚紅細數(shù)為橢圓形，胞質(zhì)染色不明顯，細胞核位于細胞中央，，呈圓形或橢圓形(1-1B)后的白細胞形態(tài)不一，由多種白細胞構(gòu)成。其中，嗜中性粒細胞的細胞核成狀，較小，位于細胞的一側(cè)。淋巴細胞的細胞核較大，核質(zhì)比較高(1-1C)。通算顯微鏡視野下各種細胞的數(shù)量以確定分離后紅細胞和白細胞的純度，我們使用細胞分離液的分離效果較好，紅細胞的純度高于 99%，而白細胞的純度 90-95%。

上海海洋大學碩士學位論文2.2 羅非魚紅細胞細胞器熒光染色結(jié)果觀察熒光染色結(jié)束后羅非魚紅細胞細胞器的染色情況見圖 1-2。如圖 1-2 所示，利用純化后的羅非魚紅細胞結(jié)合細胞器熒光染色試劑對紅細胞中的細胞器進行染色，結(jié)果顯示，染色后的紅細胞在熒光顯微鏡的觀察下顯示有綠色熒光及紅色熒光。熒光染色結(jié)果表明，在羅非魚紅細胞細中，不僅存在細胞核，在細胞質(zhì)中還存在一定的細胞器，如溶酶體和線粒體等 (圖 1-2)。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2611013