丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物,其根莖是我國傳統(tǒng)中藥,具有活血化瘀等功效。中藥丹參水溶性有效成分主要以丹酚酸為主,其中又以丹酚酸B為代表。實驗室前期研究表明丹參中多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)既能響應(yīng)干旱脅迫,又能正向調(diào)控丹酚酸B積累,但其具體作用機(jī)制還不清楚。本試驗試圖通過分子生物學(xué)手段探索PPO的生理作用和表達(dá)特點(diǎn),搜索與PPO相互作用的蛋白,通過正反向調(diào)控的方式研究PPO在丹參中可能帶來的抗脅迫能力。通過試驗得到以下結(jié)果:1.以丹參毛狀根為材料提取RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈,連接T載體,轉(zhuǎn)化測序后提質(zhì)粒,將T-PPO質(zhì)粒與酵母表達(dá)載體pGBKT7經(jīng)EcoR I,Nde I酶切,T4連接酶連接后,成功構(gòu)建pGBKT7-PPO質(zhì)粒。將pGBKT7-PPO重組質(zhì)粒和pGBKT7分別轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌感受態(tài),并涂SD/-Trp瓊脂板培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)兩者菌落的大小和數(shù)目相近,證明誘餌重組質(zhì)粒對酵母無毒性。轉(zhuǎn)化了的pGBKT7-PPO質(zhì)粒的Y2HGold酵母菌感受態(tài),稀釋不同濃度涂SD/-Trp、SD...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 丹參
        1.1.1 丹參概況
        1.1.2 丹參的藥用價值和研究現(xiàn)狀
    1.2 植物多酚氧化酶的研究進(jìn)展
        1.2.1 PPO基因結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PPO基因的表達(dá)和調(diào)控
        1.2.3 PPO的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.2.4 PPO的生理特性
    1.3 酵母雙雜交
        1.3.1 cDNA文庫
        1.3.2 酵母雙雜交系統(tǒng)
    1.4 研究方法
        1.4.1 構(gòu)建過表達(dá)與反義表達(dá)載體
        1.4.2 轉(zhuǎn)化
    1.5 研究的目的及意義
    1.6 技術(shù)路線
        1.6.1 研究內(nèi)容
        1.6.2 技術(shù)路線
第二章 PPO互作蛋白篩選
    2.1 試驗材料
        2.1.1 材料
        2.1.2 菌株及質(zhì)粒
        2.1.3 試劑及試劑盒
        2.1.4 引物和測序
        2.1.5 常用試劑和培養(yǎng)基配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 丹參總RNA提取
        2.2.2 cDNA第一鏈的合成
        2.2.3 目的基因的克隆
        2.2.4 目的片段與T載體連接
        2.2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.6 單克隆菌落的檢測
        2.2.7 構(gòu)建誘餌載體
        2.2.8 誘餌載體自激活和毒性檢測
        2.2.9 酵母雙雜交篩選與PPO相互作用的蛋白
        2.2.10 文庫滴度和鑒定
        2.2.11 菌落PCR鑒定
        2.2.12 去重復(fù)
        2.2.13 提取酵母質(zhì)粒
        2.2.14 基因序列的測定與分析
    2.3 結(jié)果分析
        2.3.1 總RNA質(zhì)量分析
        2.3.2 重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PPO的表達(dá)與鑒定
        2.3.3 酵母雙雜交對照試驗
        2.3.4 重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PPO的毒性檢測
        2.3.5 重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PPO的自激活檢測
        2.3.6 文庫滴度和插入片段長度鑒定
        2.3.7 陽性克隆子篩選
        2.3.8 陽性克隆子的PCR鑒定
        2.3.9 陽性克隆酶切去重復(fù)
        2.3.10 酵母質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)化大腸桿菌
        2.3.11 陽性克隆測序分析
第三章 PPO過表達(dá)載體和反義載體的構(gòu)建
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 菌株及質(zhì)粒
        3.1.3 試劑及試劑盒
        3.1.4 引物和測序
        3.1.5 常用試劑和培養(yǎng)基配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 目的基因的克隆
        3.2.2 目的片段與T載體連接
        3.2.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌
        3.2.4 單克隆菌落的檢測
        3.2.5 過表達(dá)和反義載體的構(gòu)建
        3.2.6 轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
        3.2.7 菌液制備
        3.2.8 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 丹參無菌苗的培養(yǎng)
        3.3.2 過表達(dá)和反義載體構(gòu)建
        3.3.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的陽性鑒定
        3.3.4 葉盤法侵染
第四章 討論
    4.1 酵母雙雜交
    4.2 過表達(dá)和反義載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌侵染
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號：3958909