發(fā)布時間：2023-11-14 18:04

　　隨著全球氣候變暖日益加劇,高溫對作物的危害越來越受到人們的重視。近年來,水稻高熱危害已成為我國長江流域水稻生產亟待解決的主要問題之一。但有關水稻高溫逆境脅迫響應的分子機制研究很少,相對水稻響應其它逆境的研究還是一個起步階段。miRNA作為植物非生物逆境應答過程中的關鍵調控因子,越來越多的證據表明miRNA對水稻的生長發(fā)育和脅迫應答起著重要的作用,miRNA研究已經成為水稻分子遺傳調控領域的熱點,有關水稻抗逆的miRNA機制的認識也不斷深入。目前,雖然已有不少水稻抗逆相關的miRNA報道,但大多數集中在低溫、干旱、高鹽、重金屬脅迫等方面,而水稻響應高溫脅迫的miRNA至今鮮有報道。因此,我們進行水稻有關應答高溫脅迫的miRNA研究,弄清miRNA及其靶標基因參與調控響應高溫逆境的途徑,在轉錄后水平上揭示出水稻響應高溫脅迫的調控機制,為水稻耐高溫品種選育、抗逆基因發(fā)掘以及高效栽培提供新的理論支持。本論文主要研究結果如下:(1)以耐熱性水稻品種Nagina 22-19379(N22)為材料,采用高通量測序技術,分析了N22高溫處理組(HT)和正常生長對照組(NT)兩個sRNA文庫,共獲得約5...

【文章頁數】：121 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮寫和符號清單
第一章 文獻綜述
    1 植物miRNA研究進展
        1.1 植物miRNA的生物合成及作用機制
        1.2 植物miRNA的功能
            1.2.1 miRNA參與植物生長發(fā)育和激素調節(jié)
            1.2.2 miRNA參與植物逆境響應調節(jié)
        1.3 植物miRNA的常用研究方法
            1.3.1 植物miRNA的獲取途徑
            1.3.2 靶標基因的預測和驗證
    2 水稻響應高溫脅迫的生理機制研究
        2.1 高溫脅迫與植物光合作用
        2.2 高溫脅迫與植物膜脂氧化、膜保護酶系統
        2.3 高溫脅迫與植物滲透調節(jié)物質
    3 水稻高溫熱害的分子機制研究
    4 水稻應答非生物學逆境miRNA的研究
    5 本研究的目的和意義
    6 研究內容
        6.1 水稻響應高溫脅迫的miRNA發(fā)掘和鑒定
        6.2 水稻miRNA靶基因的降解組測序與表達模式分析
        6.3 水稻響應高溫脅迫的miRNA的過表達分析
    7 技術路線
第二章 水稻高溫脅迫相關miRNA的分離與鑒定
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器設備
        1.4 實驗相關的數據庫及軟件
        1.5 實驗方法
            1.5.1 水稻總RNA的提取
            1.5.2 小RNA測序文庫構建與測序
            1.5.3 小RNA測序數據分析
            1.5.4 miRNA差異表達分析
            1.5.5 實時熒光定量PCR檢測差異miRNA
    2 結果與分析
        2.1 總RNA的提取
        2.2 測序序列質量分析
        2.3 Clean序列分析
        2.4 小RNA長度分布
        2.5 保守miRNA的鑒定
        2.6 新miRNA的鑒定
        2.7 miRNA的差異表達分析
        2.8 水稻高溫脅迫相關miRNA的熒光定量PCR分析
    3 討論
        3.1 高通量測序中樣品RNA的質量
        3.2 高通量測序鑒定水稻高溫脅迫相關miRNA的有效性
        3.3 水稻高溫脅迫相關miRNA的表達
第三章 水稻miRNA靶基因的降解組測序與表達模式分析
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試劑
        1.3 儀器設備
        1.4 生物信息分析相關的數據庫及軟件
        1.5 實驗方法
            1.5.1 降解組文庫的構建與測序
            1.5.2 降解組測序數據分析
            1.5.3 靶基因的功能注釋
            1.5.4 高溫應答miRNA及其靶基因的表達分析
    2 結果與分析
        2.1 水稻降解組測序數據產出總覽
        2.2 水稻響應高溫脅迫miRNA靶基因的鑒定
        2.3 GO功能注釋與富集分析
        2.4 KEEG通路分析
        2.5 KOG分類注釋分析
        2.6 高溫響應miRNA與靶基因表達模式分析
            2.6.1 定量PCR標準曲線的建立
            2.6.2 miRNA與靶基因表達模式分析
    3 討論
        3.1 降解組測序鑒定miRNA靶基因的有效性
        3.2 水稻響應高溫脅迫miRNA靶基因分析
        3.3 水稻響應高溫脅迫miRNA靶基因功能分析
第四章 水稻超表達miR162a的高溫耐受性研究
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試劑
        1.3 儀器設備
        1.4 miR162a超表達載體的構建
            1.4.1 克隆miR162a前體的引物設計
            1.4.2 水稻基因組DNA的提取
            1.4.3 miRNA前體序列的擴增
            1.4.4 目的片段的回收
            1.4.5 目的片段與載體的雙酶切連接
            1.4.6 連接產物轉化大腸桿菌DH5α
            1.4.7 重組載體pCAMBIA1301-miR162a質粒的提取
        1.5 農桿菌介導的遺傳轉化及過表達植株再生
            1.5.1 農桿菌感受態(tài)的制備與轉化
            1.5.2 水稻的遺傳轉化
        1.6 轉基因陽性植株的鑒定
            1.6.1 葉片Hyg和GUS基因的篩選
            1.6.2 GUS組織化學染色和活性檢測
            1.6.3 轉基因水稻中miR162a及其靶基因表達分析
        1.7 轉基因水稻對高溫脅迫的響應
            1.7.1 對轉基因水稻T1代幼苗進行高溫脅迫處理
            1.7.2 細胞膜透性的測定
            1.7.3 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性測定
            1.7.4 Pro含量與丙二醛(MDA)含量的測定
    2 結果與分析
        2.1 miR162a過表達載體的構建與農桿菌轉化
        2.2 農桿菌介導的遺傳轉化及植株再生
        2.3 轉基因水稻的Hyg和GUS基因的PCR檢測
        2.4 轉基因水稻GUS組織活性化學分析
        2.5 轉基因水稻中miR162a及靶標基因的表達檢測
        2.6 轉基因水稻T0代的表型分析
        2.7 高溫脅迫下轉基因水稻T1代幼苗的生理響應
    3 討論
第五章 全文總結
    1 水稻高溫響應miRNA的分離與鑒定
    2 水稻高溫響應miRNA靶基因的鑒定
    3 水稻高溫響應miRNA靶基因的功能分析
    4 過表達miR162a對水稻高溫脅迫耐受性的影響
參考文獻
附錄A
附錄B



本文編號：3863935