目的:太子參環(huán)肽HB(HeterrophyllinB,HB)是太子參的指標性成分,具有抑制酪氨酸酶合成而減少皮膚中黑色素生成的藥理作用。本研究旨在從太子參中篩選并克隆環(huán)肽HB的功能基因,并進行基因結構與功能驗證,從基因水平研究太子參環(huán)肽HB物質(zhì)的形成機制及探討相關的影響因素提供理論依據(jù)。方法:1.運用生物信息學方法從太子參轉錄組數(shù)據(jù)庫中獲得多個環(huán)肽類Unigenes序列,通過同源克隆和RACE技術克隆太子參環(huán)肽HB前體蛋白基因;運用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和液質(zhì)聯(lián)用技術(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer,LC-MS)對環(huán)肽 HB 前體蛋白基因的體外酶促反應產(chǎn)物進行檢測;構建植物表達載體,利用農(nóng)桿菌介導法轉化煙草,轉基因植株運用PCR鑒定。2.采用HPLC法和(Real-Time Quantitative PCR,RT-qPCR)技術分別檢測太子參中太子參環(huán)肽HB的含量和prePhHB基因的表達量,Excel軟件分析相關性;通過PCR擴增與TA克隆研究太子參環(huán)肽HB...

【文章頁數(shù)】：149 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
第一章 太子參環(huán)肽前體蛋白基因的克隆與驗證
    第一節(jié) 太子參環(huán)肽前體蛋白基因的克隆與序列分析
        1 實驗材料
            1.1植物材料
            1.2 菌株與載體
            1.3 酶與試劑
            1.4 實驗器材
        2 實驗方法
            2.1 太子參環(huán)肽前體蛋白基因的鑒定
            2.2 太子參總RNA提取純化與質(zhì)量檢測
            2.3 引物設計與合成
            2.4 太子參環(huán)肽前體蛋白基因核心片段擴增
            2.5 RACE技術擴增太子參prePhHB基因側翼序列
            2.6 太子參prePhHB基因序列分析
        3 實驗結果與分析
            3.1 太子參環(huán)肽前體蛋白基因的鑒定
            3.2 太子參RNA提取質(zhì)量檢測
            3.3 太子參環(huán)肽前體蛋白基因核心片段擴增
            3.4 太子參prePhHB基因側翼擴增
            3.5 太子參prePhHB基因序列分析
        4 討論
    第二節(jié) 太子參prePhHB基因的結構驗證
        1 實驗材料
            1.1 植物材料
            1.2 實驗試劑
            1.3 實驗儀器
        2 實驗方法
            2.1 前體線性肽prePhHB設計與合成
            2.2 繪制標準曲線
            2.3 太子參粗酶提取
            2.4 提取粗酶質(zhì)量檢測
            2.5 prePhHB基因的結構驗證
        3 實驗結果與分析
            3.1 提取粗酶質(zhì)量檢測
            3.2 太子參prePhHB體外酶促產(chǎn)物定量分析
            3.3 太子參prePhHB體外酶促產(chǎn)物定性分析
        4 討論
    第三節(jié) 太子參prePhHB基因在轉基因煙草中表達驗證
        1 實驗材料
            1.1植物材料
            1.2 菌株與載體
            1.3 酶與試劑
            1.4 引物設計與合成
        2 實驗方法
            2.1 prePhHB基因植物表達載體構建
            2.2 LBA4404-PLGNL-prePhHB轉化菌液制備
            2.3 prePhHB基因煙草轉化
            2.4 轉基因煙草PCR鑒定
        3 結果與分析
            3.1 prePhHB基因植物表達載體構建與鑒定
            3.2 prePhHB轉基因煙草獲得
            3.3 prePhHB轉基因煙草分子鑒定
        4 討論
第二章 不同種源太子參中環(huán)肽HB含量差異與太子參prePhHB基因的相關性研究
    第一節(jié) 不同種源太子參中環(huán)肽HB含量分析
        1 實驗材料
            1.1 實驗樣品
            1.2 實驗試劑
            1.3 實驗儀器
        2 實驗方法
            2.1 色譜條件
            2.2 對照品溶液制備
            2.3 供試品溶液制備
            2.4 不同種源太子參中環(huán)肽I-HB含量測定
        3 實驗結果與分析
        4 討論
    第二節(jié) 不同種源太子參中prePhHB基因表達分析
        1 實驗材料
            1.1 供試材料
            1.2 試劑與酶
            1.3 實驗儀器
        2 實驗方法
            2.1 太子參總RNA提取與合成cDNA第一鏈
            2.2 引物設計與合成
            2.3 cDNA第一鏈質(zhì)量檢測
            2.4 引物質(zhì)量檢測
            2.5 不同種源太子參prePhHB基因表達分析
            2.6 不同種源太子參prePhHB表達量與太子參環(huán)肽HB含量的相關性分析
        3 結果與分析
            3.1 太子參總RNA質(zhì)量檢測
            3.2 第一鏈cDNA質(zhì)量檢測
            3.3 引物質(zhì)量檢測
            3.4 實時熒光定量PCR反應靈敏性和特異性檢測
            3.5 不同種源太子參prePhHB基因表達分析
            3.6 不同種源太子參prePhHB表達量與太子參環(huán)肽HB含量相關性分析
        4 討論
    第三節(jié) 不同種源太子參prePhHB基因表達差異的克隆分析
        1 實驗材料
            1.1 供試材料
            1.2 試劑與酶
            1.3 實驗儀器
        2 實驗方法
            2.1 太子參總RNA提取與質(zhì)量檢測
            2.2 引物設計與合成
            2.3 不同種源太子參prePhHB基因表達差異的克隆
        3 結果與分析
            3.1 不同種源太子參prePhHB基因表達差異的PCR擴增
            3.2 不同種源太子參prePhHB基因表達差異的克隆與測序
            3.3 不同種源太子參prePhHB基因表達差異的克隆序列分析
        4 討論
第三章 外源脫落酸和赤霉素對太子參prePhHB基因表達的影響
    第一節(jié) 太子參中內(nèi)源激素含量與prePhHB基因表達量相關性分析
        1 實驗材料
            1.1 植物材料
            1.2 實驗儀器
            1.3 試劑
        2 實驗方法
            2.1 不同生長時期太子參中內(nèi)源激素含量測定
            2.2 不同生長時期太子參中prePhHB基因表達量檢測
            2.3 內(nèi)源激素含量與prePhHB基因表達量相關性分析
        3 結果與分析
            3.1 ELISA檢測標準曲線繪制
            3.2 不同時期內(nèi)源激素含量變化
            3.3 太子參總RNA質(zhì)量檢測
            3.4 第一鏈cDNA質(zhì)量檢測
            3.5 prePhHB基因表達分析
            3.6 內(nèi)源激素含量與prePhH田基因表達量相關性
        4 討論
    第二節(jié) 外源脫落酸與赤霉素對太子參中內(nèi)源激素含量影響
        1 實驗材料
            1.1 供試材料
            1.2 實驗儀器
            1.3 實驗試劑
        2 實驗方法
            2.1 材料處理與取樣
            2.2 ELISA法檢測原理
            2.3 提取植物內(nèi)源激素
            2.4 ELISA法測定內(nèi)源激素含量
            2.5 結果計算與分析方法
        3 結果與分析
            3.1 ELISA檢測繪制標準曲線
            3.2 外源激素及其抑制劑處理后太子參中內(nèi)源激素含量變化分析
        4 討論
    第三節(jié) 外源脫落酸與赤霉素對太子參prePhHB基因表達影響
        1 實驗材料
            1.1 植物材料
            1.2 實驗儀器
            1.3 試劑與酶
        2 實驗方法
            2.1 總RNA提取與質(zhì)量檢測
            2.2 合成第一鏈cDNA
            2.3 引物設計與合成
            2.4 prePhHB基因表達分析
        3 結果與分析
            3.1 太子參總RNA質(zhì)量檢測
            3.2 第一鏈cDNA質(zhì)量檢測
            3.3 prePhHB基因表達分析
        4 討論
全文結論與展望
參考文獻
附錄一 綜述
    參考文獻
附錄二 太子參RNA提取質(zhì)量檢測
附錄三 太子參環(huán)肽HB、PG核苷酸序列
附錄四 不同種源太子參藥材圖片
附錄五 陽性重組植物表達載體PLGNL-prePhHB測序圖片
附錄六 外源ABA、GA3處理太子參圖片
附錄七 不同生長時期太子參樣品實時熒光定量PCR擴增曲線和溶解曲線
附錄八 致謝
附錄九 作者簡介



本文編號：3750298