在逆境脅迫環(huán)境下,生物會(huì)通過調(diào)節(jié)自身的蛋白合成來適應(yīng)脅迫環(huán)境。其中,在脅迫和氮/氨基酸信號(hào)之間起到重要連接作用的一個(gè)蛋白激酶叫作GCN2（General Control Non-derepressible 2）,其主要作用是通過磷酸化真核起始翻譯因子eIF2α（αsubunit of eukaryotic translation initiation factor 2）來調(diào)節(jié)蛋白的合成,從而對(duì)各種脅迫做出應(yīng)答。目前,關(guān)于GCN2的研究在動(dòng)物和微生物細(xì)胞中已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展,而在植物中的研究相對(duì)較少,并且主要集中在擬南芥中。本研究根據(jù)煙草NtGCN2（GenBank登錄號(hào):KJ706220）的全長序列克隆出其功能域（Protein Kinases catalytic domain,PKc）序列,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET15b-PKc,采用大腸桿菌表達(dá)菌BL21–CodonPlus-（DE3）-RIPL進(jìn)行蛋白表達(dá),采用Ni²⁺-NTA瓊脂糖親和層析柱、陰離子交換柱Hitrp Q和分子篩對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行純化,獲得了純化蛋白。采用該蛋白制備了相應(yīng)的多克隆抗體,并檢... 

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 GCN2 參與途徑
        1.1.1 GCN2 介導(dǎo)的e IF2 蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控
        1.1.2 GCN2 介導(dǎo)的GCN4 蛋白的翻譯調(diào)控
        1.1.3 GCN2 介導(dǎo)的ATF4 蛋白的翻譯調(diào)控
    1.2 GCN2 的結(jié)構(gòu)
    1.3 GNC2 的功能
    1.4 GCN2 的研究現(xiàn)狀
        1.4.1 GCN2 對(duì)脅迫的響應(yīng)
        1.4.2 GCN2 的激活
2 引言
    2.1 研究目的與意義
    2.2 研究內(nèi)容
3 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
        3.1.2 試劑
        3.1.3 植物材料
        3.1.4 常用試劑配置
        3.1.5 常用培養(yǎng)基配置
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2.1.1 PCR反應(yīng)體系
            3.2.1.2 PCR產(chǎn)物的純化
            3.2.1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2.1.4 菌落PCR驗(yàn)證
            3.2.1.5 質(zhì)粒的提取
            3.2.1.6 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
            3.2.1.7 DNA測(cè)序
        3.2.2 IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)誘導(dǎo)的重組蛋白的原核表達(dá)
        3.2.3 重組蛋白的提取
        3.2.4 目的蛋白的純化
            3.2.4.1 Ni~(2+)-NTA瓊脂糖柱純化蛋白
            3.2.4.2 陰離子交換柱Hitrap Q純化蛋白
            3.2.4.3 分子篩純化蛋白
        3.2.5 SDS-PAGE電泳
        3.2.6 Western-blotting檢測(cè)
        3.2.7 GCN2 功能域(PKc)抗體制備
        3.2.8 抗體的效價(jià)檢測(cè)
        3.2.9 免疫共沉淀(Co-IP)初步篩選煙草中與GCN2 存在相互作用的蛋白
            3.2.9.1 煙草蛋白的提取
            3.2.9.2 Co-IP實(shí)驗(yàn)方法
4 結(jié)果與分析
    4.1 原核表達(dá)載體pET15b-PKc的構(gòu)建
        4.1.1 NtGCN2 功能域(PKc)基因的克隆
        4.1.2 菌落PCR的驗(yàn)證
        4.1.3 質(zhì)粒驗(yàn)證
    4.2 GCN2 功能域(PKc)的原核表達(dá)及Western blot鑒定
        4.2.1 GCN2 功能域(PKc)的原核表達(dá)及條件優(yōu)化
        4.2.2 重組蛋白的Western-bloting鑒定
    4.3 重組蛋白pET15b-PKc的純化
        4.3.1 Ni~(2+)-NTA瓊脂糖柱初步純化目的蛋白
        4.3.2 陰離子交換柱Hitrap Q純化目的蛋白
        4.3.3 分子篩純化目的蛋白
    4.4 多克隆抗體的制備、純化和效價(jià)檢測(cè)
        4.4.1 GCN2 全長蛋白多克隆抗體的制備與效價(jià)檢測(cè)
        4.4.2 GCN2 功能域(PKc)蛋白多克隆抗體的制備與效價(jià)檢測(cè)
        4.4.3 GCN2 功能域(PKc)多克隆抗體的鑒定與純化
        4.4.4 采用制備的PKc抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草GCN2 的表達(dá)
    4.5 NtGCN2 互作蛋白的初步篩選
5 結(jié)論與討論
    5.1 討論
    5.2 結(jié)論
    5.3 研究的創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
英文摘要


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]煙草NtGCN2的克隆與表達(dá)分析[J]. 張康旭,劉國順,李雯雯,王葉青,楊永霞,賈宏昉,張洪映,崔紅,張松濤.  植物生理學(xué)報(bào). 2014(09)
[2]改善稀有密碼子和氨基酸殘基限制提高重組人ADAM15去整合素結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)水平[J]. 吳靜,雷楗勇,張蓮芬,花慧,金堅(jiān).  微生物學(xué)報(bào). 2008(08)
[3]重組人血管內(nèi)皮抑制素（rh-Endostatin）大腸桿菌表達(dá)體系發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 常國棟,李壯林,秦加陽,馬翠卿,羅永章,許平.  生物工程學(xué)報(bào). 2005(04)



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