作為世界主要糧食作物之一,水稻（Oryza sativa L.）的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)對保障糧食安全具有至關重要的意義。水稻在生產(chǎn)過程中對水分有極大需求,然而,我國水資源匱乏,旱災頻發(fā),隨著全球環(huán)境惡化與氣候異常加劇了旱災的程度,這使得水稻的生產(chǎn)受到非常嚴峻的挑戰(zhàn)。因此,挖掘水稻抗旱基因,探究水稻抗旱機理,從而培育具有節(jié)水抗旱特性的水稻品種,對于穩(wěn)定糧食安全十分重要。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通過調(diào)控一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄,在植物生長發(fā)育、抵御逆境等方面發(fā)揮重要作用,因此挖掘與鑒定水稻中與抗旱性相關的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,對培育節(jié)水抗旱稻（WDR）具有重要價值。本實驗室前期選取了不同抗旱類型的典型材料,進行了耐旱性分析和轉(zhuǎn)錄組測序分析,獲得了多個耐旱性基因共表達網(wǎng)絡的節(jié)點。本文對其中的5個編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因進行克隆和轉(zhuǎn)基因材料的創(chuàng)制。并對其中一個編碼AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的Os ERF65基因進行了詳細的功能研究。主要結(jié)果如下:1. 對5個編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的耐旱候選基因進行了基因克隆、超表達載體和CRISPR/Cas9基因敲除載體的構(gòu)建,并且利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對日本晴水稻進行了遺傳轉(zhuǎn)化,通過分子鑒定獲得了相應的轉(zhuǎn)基因... 

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫名詞表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 植物的抗旱性
        1.2.1 植物抗旱性的類型
        1.2.2 植物抗旱性的鑒定指標
            1.2.2.1 形態(tài)指標
            1.2.2.2 生長指標
            1.2.2.3 生理生化指標
    1.3 植物在非生物脅迫下的應答調(diào)控
        1.3.1 植物對非生物脅迫應答的一般途徑
        1.3.2 植物激素在植物非生物脅迫信號傳遞中的作用
            1.3.2.1 ABA在植物非生物脅迫信號傳遞中的作用
            1.3.2.2 乙烯在植物非生物脅迫信號傳遞中的作用
    1.4 植物中ERF轉(zhuǎn)錄因子研究進展
        1.4.1 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)構(gòu)特征與分類
        1.4.2 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物應對非生物脅迫時的作用
            1.4.2.1 AP2/ERF家族在植物應對干旱脅迫時的作用
            1.4.2.2 AP2/ERF家族在植物應對其他非生物脅迫中的作用
    1.5 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 水稻材料
    2.2 菌株與載體
    2.3 耐旱候選基因的篩選、克隆及生物信息學分析
    2.4 載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4.1 耐旱候選基因超量表達載體的構(gòu)建
        2.4.2 耐旱候選基因CRISPR/Cas9 敲除載體的構(gòu)建
        2.4.3 遺傳轉(zhuǎn)化
    2.5 表達量檢測
        2.5.1 RNA提取及cDNA合成
        2.5.2 實時定量PCR
    2.6 轉(zhuǎn)基因植株檢測
        2.6.1 超表達轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
        2.6.2 CRISPR/Cas9 敲除轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
    2.7 用于候選基因表達模式分析的材料
    2.8 水稻材料苗期抗逆性鑒定
    2.9 水稻抗逆性相關生理指標的檢測
        2.9.1 過氧化氫含量的測定
        2.9.2 丙二醛含量的測定
        2.9.3 脯氨酸含量的測定
    2.10 轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)錄組測序分析
        2.10.1 轉(zhuǎn)錄組測序
        2.10.2 差異表達基因的驗證
    2.11 目標蛋白的亞細胞定位分析
        2.11.1 煙草葉片瞬時表達
        2.11.2 水稻原生質(zhì)體瞬時表達
    2.12 酵母細胞中的生化實驗
        2.12.1 酵母中的反式激活活性鑒定
        2.12.2 酵母雙雜交
3 結(jié)果與分析
    3.1 水稻耐旱性轉(zhuǎn)錄因子的挖掘和轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建
        3.1.1 轉(zhuǎn)基因植株耐旱性轉(zhuǎn)錄組分析及候選基因挖掘
        3.1.2 耐旱候選基因的克隆、超量表達和基因敲除載體的構(gòu)建及水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        3.1.3 耐旱候選基因超表達轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
        3.1.4 耐旱候選基因敲除轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
    3.2 水稻耐旱候選基因OsERF65的功能研究
        3.2.1 OsERF65序列分析
        3.2.2 OsERF65蛋白序列比對與聚類分析
        3.2.3 OsERF65基因上游啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析
        3.2.4 OsERF65在逆境下的表達模式分析
        3.2.5 OsERF65蛋白的亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性分析
        3.2.6 OsERF65的轉(zhuǎn)基因植株的獲得
        3.2.7 OsERF65超表達材料的耐旱性分析
        3.2.8 oserf65突變體材料的耐旱性分析
        3.2.9 OsERF65轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)錄組測序分析
        3.2.10 下游DEGs啟動子的順式作用元件分析
        3.2.11 OsERF65互作蛋白的篩選及驗證
        3.2.12 Os ERF65在WDR中的表達模式分析
4 討論
    4.1 OsERF65正調(diào)控水稻的耐旱性
    4.2 Os ERF65 編碼一個典型的ERF轉(zhuǎn)錄因子
    4.3 OsERF65的表達受非生物逆境脅迫的誘導
    4.4 Os ERF65對WDR育種的意義
參考文獻
附錄
    附錄Ⅰ 附圖
    附錄Ⅱ 附表
    附錄Ⅲ 部分實驗的詳細操作程序
    附錄Ⅳ 作者簡介
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3677219