肉桂醇脫氫酶（CAD）能夠?qū)⑷夤鹑┻�原生成相應的肉桂醇,是苯丙素類化合物生物合成途徑中的關鍵酶之一。細辛的主要功效物質(zhì)是揮發(fā)油,而揮發(fā)油主要組成成分甲基丁香酚等芳香族化合物都基于苯丙素類代謝途徑。因此,分離細辛cad基因并進行功能驗證,是闡明細辛主要活性成分生物合成分子調(diào)控機制、開展細辛種質(zhì)遺傳改良、提升細辛藥材品質(zhì)的理論基礎。在基于同源克隆的原理和方法獲得cad基因序列的基礎上,本研究運用在線分析工具及應用軟件,對華細辛cad基因編碼的蛋白進行生物信息學分析,了解其基本理化性質(zhì)和功能結(jié)構(gòu)信息。同時通過TOPO克隆和LR反應構(gòu)建重組質(zhì)粒,經(jīng)菌落PCR和測序檢測成功后將其導入大腸桿菌BL21中,用IPTG誘導其表達蛋白。然后依次對蛋白進行可溶性分析、親和層析法純化、SDS-PAGE和Western Blot檢測,ELISA分析法定量測定。生物信息學分析結(jié)果顯示,cad基因開放閱讀框共編碼356個氨基酸;基本理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),其編碼蛋白為酸性親水性蛋白,而且穩(wěn)定性較好;結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),其蛋白家族類型為醇脫氫酶超家族,具有鋅指結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)域包括GroES-like區(qū)域、NAD（P）結(jié)合區(qū)域和聚酮... 

【文章來源】：上海交通大學上海市211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 細辛研究概況
        1.1.1 細辛的分類、產(chǎn)地和藥用部位
        1.1.2 細辛的藥理作用
        1.1.3 細辛揮發(fā)油的含量及提取方法
    1.2 甲基丁香酚研究進展
        1.2.1 甲基丁香酚應用價值
        1.2.2 甲基丁香酚的毒性
        1.2.3 甲基丁香酚含量測定方法
        1.2.4 甲基丁香酚生物合成途徑
    1.3 cad基因研究進展
        1.3.1 cad基因的起源與分類
        1.3.2 cad基因的酶學性質(zhì)
        1.3.3 cad基因的功能與分布
        1.3.4 cad基因的表達特性
        1.3.5 cad基因的克隆
    1.4 立題背景與意義
第二章 華細辛cad基因生物信息學分析
    2.1 引言
    2.2 主要分子生物學數(shù)據(jù)庫和軟件
        2.2.1 網(wǎng)絡資源
        2.2.2 應用軟件
    2.3 分析結(jié)果與討論
        2.3.1 華細辛cad基因開放閱讀框(ORF)分析
        2.3.2 華細辛cad基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析
        2.3.3 華細辛cad基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析
        2.3.4 華細辛cad基因編碼蛋白質(zhì)功能預測
        2.3.5 華細辛cad基因同源性分析
        2.3.6 華細辛cad基因分子進化樹分析
    2.4 本章小結(jié)
第三章 華細辛cad基因的原核表達
    3.1 引言
    3.2 實驗材料、試劑與儀器
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗試劑
        3.2.3 實驗儀器
        3.2.4 配制所需的試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 華細辛葉片總RNA的提取
        3.3.2 cDNA合成
        3.3.3 擴增cad基因
        3.3.4 目的片段切膠回收
        3.3.5 TOPO克隆
        3.3.6 提取質(zhì)粒與序列測定
        3.3.7 LR反應
        3.3.8 重組蛋白的誘導表達
        3.3.9 蛋白純化
        3.3.10 SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳
        3.3.11 Western blot分析
        3.3.12 ELISA分析
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 華細辛葉片總RNA提取
        3.4.2 cDNA合成
        3.4.3 cad基因PCR擴增
        3.4.4 切膠回收與TOPO克隆
        3.4.5 提取質(zhì)粒
        3.4.6 LR反應分析
        3.4.7 蛋白質(zhì)可溶性分析
        3.4.8 蛋白質(zhì)分離純化
        3.4.9 蛋白質(zhì)含量變化分析與測定
    3.5 本章小結(jié)
第四章 研究總結(jié)與展望
    4.1 研究總結(jié)
        4.1.1 生物信息學結(jié)果分析
        4.1.2 原核表達結(jié)果分析與問題討論
    4.2 工作展望
參考文獻
附錄
致謝
攻讀碩士學位期間已發(fā)表或錄用的論文


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]水蒸氣蒸餾法和超聲輔助提取法提取華細辛揮發(fā)油的比較[J]. 潘紅亮,歐陽天贄.  食品科學. 2011(10)
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碩士論文
[1]CEM15基因的生物信息學分析[D]. 王翊.電子科技大學 2005



本文編號：3636715