木薯（Manihot esculenta Crantz）起源于南美洲,是熱帶地區(qū)重要的糧食作物和能源植物。中性/堿性轉(zhuǎn)化酶是木薯淀粉積累過程中的一種關(guān)鍵酶,前人已從木薯中克隆出了中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因家族的11個成員（MeNINV1～10和nINV1）,并對其結(jié)構(gòu)進化和表達(dá)情況進行了分析。但將它們在染色體上進行物理定位的報道尚少。本研究以木薯華南6號品種的古銅期嫩葉為材料,制備染色體標(biāo)本,采用熒光原位雜交和原位PCR技術(shù),對木薯中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因家族的10個成員進行了物理定位,明確了它們的分布特點,并闡明了該基因家族與其他功能基因的連鎖關(guān)系。具體結(jié)果如下:（1）對采用木薯華南6號古銅期嫩葉制備染色體標(biāo)本的方法進行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn):最適的預(yù)處理方法是使用飽和對二氯苯溶液處理1.5 h,最適的酶解方案是在5%纖維素酶和4%果膠酶的混合液中37℃條件下酶解4.5 h。（2）對熒光原位雜交過程中的漂洗步驟進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,雜交后,3次漂洗的時間分別為5 min、5 min和8 min時,標(biāo)本背景最干凈。（3）利用單色熒光原位雜、雙色熒光原位雜交和原位PCR技術(shù),對木薯中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因家... 

【文章來源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１間接法ＨＳＨ技術(shù)的基本原理示意圖??探針與染色體雜交后，經(jīng)過免疫檢測，在目標(biāo)染色體上顯示熒光信號

木薯中性／堿性轉(zhuǎn)化酶基因家族的物理定位流控芯片－熒光原位雜交技術(shù)??控芯片（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ）是一種把醫(yī)學(xué)、生物、化學(xué)等分析過程中的應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完技術(shù)。與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合的焚光原位雜交技術(shù)（ＦＩＳＨ?ｏｎ?ｍｉｃｒｏｃ時間內(nèi)完成檢測，而且是自動完成，與傳統(tǒng)的ＦＩＳＨ相比，ＦＩＳＨｏｎｍｉｃｒｏ約７０％的試劑，而且可以大大的降低對操作人員的要求。其原理是將整對獨立的兩個部分，兩部分可以獨立的加熱、冷卻、反應(yīng)，但兩者間有通。各部分又被分為周圍的裝載室和中間的反應(yīng)室，以常閉閥連接。通過統(tǒng)控制各閥的開關(guān)可以控制試劑在各室間流動，其動力主要是吸入型和泵。其本質(zhì)就是微泵膜轉(zhuǎn)動產(chǎn)生壓力差配合特定的開關(guān)引起試劑定向流應(yīng)有序進行。ＦＩＳＨ?ｏｎ?ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ技術(shù)流程如圖２。??．．．???－－＾°

３．１．１．１預(yù)處理時間的優(yōu)化??本研宄采用飽和對二氯苯溶液４°Ｃ處理的方法，設(shè)置了】ｈ、１．５ｈ、２ｈ三個梯度??對預(yù)處理的最佳時長進行了摸索（圖３Ａ，?３Ｂ，３Ｃ）。結(jié)果表明：在其他條件一致的情??況下，預(yù)處理ｌｈ的材料所制備的標(biāo)本中，染色體聚縮不完全，形態(tài)不清晰，不利于??染色體計數(shù)、長度測定的分析（圖３Ａ）；預(yù)處理１．５?ｈ的材料所制備的標(biāo)本中，大多??中期細(xì)胞的染色體聚縮合適，無拖尾現(xiàn)象，形態(tài)清晰，很適合做核型分析（圖３Ｂ）；??預(yù)處理２ｈ的材料所制備的標(biāo)本中，雖然染色體的形態(tài)清晰，但聚縮過度，長度大大??減小，著絲粒己不可辨識，不利于核型分析（圖３Ｃ）。??綜上所述，研宄認(rèn)為對木薯古銅期嫩葉的預(yù)處理，宜采用飽和對二氯苯溶液４°Ｃ??條件下處理１．５?ｈ的方法，這樣獲得的材料，中期細(xì)胞更多，且染色體形態(tài)好，利于??核型分析。??ＡＢＣ??圖３不同預(yù)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]木薯堿性/中性轉(zhuǎn)化酶MeNINV1基因啟動子的克隆及激素應(yīng)答表達(dá)分析[J]. 王運林,姚遠(yuǎn),耿夢婷,孫沖,尚璐,李瑞梅,符少萍,胡新文,郭建春.  分子植物育種. 2017(02)
[2]不同密度玉米群體子粒轉(zhuǎn)化酶與灌漿強度的關(guān)系[J]. 李光彥,許艷麗,盧霖,王慶燕,董志強.  玉米科學(xué). 2016(04)
[3]木薯蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SUT）家族基因的染色體物理定位[J]. 李晶晶,王英,高和瓊,李開綿,莊南生.  分子植物育種. 2016(04)
[4]一種穩(wěn)定的人卵母細(xì)胞染色體熒光原位雜交技術(shù)[J]. 李鵬昊,曲婷,黃繼華,韓婷婷,溫子娜,崔淑艷,鐘影.  癌變·畸變·突變. 2016(02)
[5]木薯淀粉合成相關(guān)基因SBE和GBSS的物理定位[J]. 劉平平,王英,高和瓊,李開綿,莊南生.  分子植物育種. 2015(10)
[6]甌柑中性轉(zhuǎn)化酶基因（CrInv1）克隆及序列特征分析[J]. 金微微,陳功楷,郜愛玲.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2015(16)
[7]巴西橡膠樹膠乳轉(zhuǎn)化酶HbNIN基因家族物理定位的研究[J]. 高佳佳,王英,高和瓊,朱穩(wěn),莊南生.  熱帶作物學(xué)報. 2014(09)
[8]13份木薯種質(zhì)資源多樣性分析與系統(tǒng)評價[J]. 謝向譽,陸柳英,曾文丹,張雅媛,李明娟,嚴(yán)華兵.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2014(24)
[9]巴西橡膠樹4個環(huán)鋅指蛋白基因（HbRZF）的物理定位[J]. 官錦燕,王英,高和瓊,莊南生.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2014(03)
[10]熒光原位雜交技術(shù)的研究進展[J]. 何世斌,柴連琴,譚珺雋,沈堯,周萍,馬云峰,李立家.  植物科學(xué)學(xué)報. 2014(02)

博士論文
[1]木薯野生種和栽培種塊根轉(zhuǎn)錄組研究[D]. 宋紅艷.海南大學(xué) 2014
[2]木薯莖稈作為生物質(zhì)能原料的化學(xué)特性研究[D]. 韋茂貴.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]木薯塊根淀粉形態(tài)發(fā)生與積累的酶活性動態(tài)初步研究[D]. 閔義.海南大學(xué) 2010
[4]利用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對中國明對蝦和櫛孔扇貝若干重要基因定位的研究[D]. 郇聘.中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所） 2009
[5]甘蔗親本種特異DNA序列的PCR檢測及原位PCR定位的研究[D]. 王英.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[6]熒光原位雜交技術(shù)在大白菜染色體基因定位中的應(yīng)用研究[D]. 軒淑欣.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[7]幾種植物與模式植物基因組的分子細(xì)胞遺傳學(xué)比較分析[D]. 佘朝文.武漢大學(xué) 2005
[8]水稻轉(zhuǎn)化酶基因家族的進化及其在干旱脅迫下的表達(dá)調(diào)控[D]. 紀(jì)雪梅.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2005
[9]果實酸性轉(zhuǎn)化酶研究[D]. 潘秋紅.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2003

碩士論文
[1]枳堿性/中性轉(zhuǎn)化酶基因PtrA/NINV功能分析[D]. 巴沙爾（BACHAR DAHRO）.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]枳中性轉(zhuǎn)化酶基因PtrNINV克隆及其功能分析[D]. 王菲.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[3]木薯遺傳圖譜10個標(biāo)記位點的物理定位[D]. 王婧菲.海南大學(xué) 2013
[4]木薯遺傳圖譜9號、17號和18號連鎖群物理定位的研究[D]. 王超.海南大學(xué) 2012
[5]木薯SBEⅡ和MeEFⅠ基因物理定位的研究[D]. 馮耀文.海南大學(xué) 2011
[6]巴西橡膠樹REF、RT和SRPP基因物理定位的研究[D]. 邱海燕.海南大學(xué) 2010
[7]橡膠樹膠乳中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆及其表達(dá)特性研究[D]. 劉術(shù)金.海南大學(xué) 2010
[8]巴西橡膠樹HbMyb1基因和OPV-10390連鎖標(biāo)記原位PCR定位的研究[D]. 高和瓊.海南大學(xué) 2008
[9]石蒜與忽地笑熒光原位雜交研究[D]. 程曉蕾.南京林業(yè)大學(xué) 2006
[10]原位逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2（ppGalNAcT2）在腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織中的差異表達(dá)[D]. 胡笳.蘇州大學(xué) 2003



本文編號：3435654