1目的（1）基于ITS序列分析,開(kāi)發(fā)霍山石斛特異性PCR引物,用于鑒別霍山石斛、鐵皮石斛和河南石斛。（2）開(kāi)發(fā)霍山石斛微衛(wèi)星位點(diǎn),豐富霍山石斛微衛(wèi)星文庫(kù)內(nèi)容,以期開(kāi)發(fā)出一對(duì)用于鑒別霍山石斛和銅皮石斛的特異性微衛(wèi)星引物,同時(shí)為后期研究霍山石斛遺傳結(jié)構(gòu)及其多樣性提供基礎(chǔ)。（3）基于重測(cè)序開(kāi)發(fā)霍山石斛和銅皮石斛之間的SNP位點(diǎn),用于鑒別霍山石斛和銅皮石斛。2方法（1）通過(guò)測(cè)序得到四種石斛的ITS序列,聯(lián)合GenBank下載的序列,在BioEdit分析軟件進(jìn)行比對(duì)分析,利用primer5及olige6軟件針對(duì)霍山石斛及其偽品鐵皮石斛和河南石斛之間序列的差異位點(diǎn),設(shè)計(jì)特異性引物。PCR反應(yīng),電泳檢測(cè),以篩選霍山石斛呈陽(yáng)性反應(yīng)（有亮帶）,而鐵皮石斛和河南石斛呈陰性反應(yīng)（無(wú)亮帶）的引物為目標(biāo)引物。并進(jìn)行樣本驗(yàn)證。（2）基于微衛(wèi)星位點(diǎn)（SSR）多態(tài)性高的特點(diǎn),分別以（CT）12、（GAA）8為雜交探針,采用磁珠富集法開(kāi)發(fā)霍山石斛的微衛(wèi)星位點(diǎn),并在開(kāi)發(fā)所得的微衛(wèi)星位點(diǎn)片段兩端設(shè)計(jì)正反向引物,對(duì)霍山石斛和銅皮石斛進(jìn)行PCR反應(yīng),篩選能明顯區(qū)分霍山石斛和銅皮石斛的引物。（3）以鐵皮石斛基因組序列為參考基因,... 

【文章來(lái)源】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：83 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

種石斛植株照片

大別山產(chǎn)四種石斛的分子生物學(xué)鑒定簡(jiǎn)約法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，2 種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致（圖 1-2）。此外，在貝葉斯樹(shù)中，依據(jù) AIC 標(biāo)準(zhǔn)選取 K80+G 為序列的最適模型。在以菱唇石斛 D. leptocladum 為外類群構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，霍山石斛與鐵皮石斛和河南石斛的所有單倍型都各自聚為單系分支。其中，鐵皮石斛和河南石斛都得到了高度的支持（BS=1.00；PP=100，BS=0.98；PP=98），而霍山石斛的自舉支持度和后驗(yàn)概率值均相對(duì)較低（BS=0.90；PP=67）。此外，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，霍山石斛與河南石斛互為姐妹類群，形成并系，親緣關(guān)系更近，而鐵皮石斛與霍山石斛和河南石斛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。上述結(jié)果表明，ITS 序列可以作為霍山石斛及鐵皮石斛和河南石斛的鑒別條形碼。

第一章 特異性 PCR 鑒別霍山石斛2.2 DNA 模板質(zhì)量檢測(cè)本研究利用在保守區(qū)設(shè)計(jì)的通用引物 SH-TY1s/SH-TY1a 對(duì)所提取的樣品DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)。反應(yīng)總體系為 25 μL，包括 DNA 模板 0.5 μL，上游引物SH-TY1s和下游引物SH-TY1a各1 μL（10 pmol），10 ×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）0.5 μL，Taq DNApolymerase（5 u/μL）0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。結(jié)果可見(jiàn)圖 1-3。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析球花石斛的遺傳多樣性并鑒定其藥材的地理來(lái)源[D]. 袁英惠.南京師范大學(xué) 2011



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