由于干旱、鹽堿等非生物脅迫因子已經(jīng)成為影響當(dāng)前農(nóng)作物種植的重要因素,提高農(nóng)作物本身的抗逆能力變得尤為重要。作為水稻的變種,旱稻在某些逆境中有著自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),因此優(yōu)化旱稻性狀也越來(lái)越成為熱門的研究方向。本課題是對(duì)前期獲得的轉(zhuǎn)小立碗蘚胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白家族LEA₃亞家族樣蛋白基因（Gene ID:112289949,將該基因命名為L(zhǎng)EA8981）的旱稻轉(zhuǎn)基因株系后代進(jìn)行篩選和分析,主要結(jié)果如下:將篩選得到的候選純合轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southern雜交分析,以鑒定外源基因（LEA8981）拷貝數(shù)。獲得了2個(gè)單拷貝株系、10個(gè)2拷貝株系和9個(gè)多拷貝株系,并將其中12個(gè)含有1-2拷貝數(shù)的株系進(jìn)行了RT-PCR分析,以分析各個(gè)低拷貝株系中LEA8981基因的相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果顯示,有7個(gè)株系中LEA8981的轉(zhuǎn)錄水平較高,為后續(xù)篩選具有優(yōu)良抗逆性的旱稻新品系奠定了基礎(chǔ)。研究中發(fā)現(xiàn),與野生型相比,單拷貝轉(zhuǎn)基因純合株系3-28明顯矮化,且能穩(wěn)定遺傳。對(duì)其進(jìn)行Tail-PCR檢測(cè),證明LEA8981基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到基因組10號(hào)染色體中,并確定了具體的插入位點(diǎn)。為進(jìn)一步明確該株系... 

【文章來(lái)源】：河北科技大學(xué)河北省

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

轉(zhuǎn)基因植株實(shí)驗(yàn)室除草劑篩選注：A和B分別是株系3-20噴除草劑和噴除草劑5天后的對(duì)比圖；C和D分別是株系3-54噴除草劑和噴除草劑5天后的對(duì)比圖

圖 2-2 轉(zhuǎn) LEA8981 基因質(zhì)粒電泳結(jié)果注：M 為 Marker，1、2、3、4 分別為所提的四管質(zhì)粒系的 PCR 檢測(cè)結(jié)果及分析結(jié)果為純合的株系每個(gè)株系提取 18 個(gè)以上的單株檢測(cè)，其中以質(zhì)粒為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，簡(jiǎn)寫為號(hào)野生型為模板作為陰性對(duì)照，簡(jiǎn)寫為“-”；無(wú)菌株提取的 DNA 作為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物分3 所示，陽(yáng)性對(duì)照有特異條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照，并且和質(zhì)粒擴(kuò)增的條帶大小一致，因此可以初有目的基因，即為候選純合株系。圖 2-4 所示，陽(yáng)白對(duì)照沒有條帶，1-21 號(hào)大部分樣品有條帶，但 只是后代部分單株含有目的基因，即該株系為雜選出的 44 個(gè)株系全部進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，共篩選出 個(gè)。

圖 2-2 轉(zhuǎn) LEA8981 基因質(zhì)粒電泳結(jié)果注：M 為 Marker，1、2、3、4 分別為所提的四管質(zhì)粒2.4.3 轉(zhuǎn)基因株系的 PCR 檢測(cè)結(jié)果及分析將除草劑鑒定結(jié)果為純合的株系每個(gè)株系提取 18 個(gè)以上的單株的 DNA 進(jìn)行目的基因的 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，其中以質(zhì)粒為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，簡(jiǎn)寫為“+”；未轉(zhuǎn)入目的基因的鯤旱 1 號(hào)野生型為模板作為陰性對(duì)照，簡(jiǎn)寫為“-”；無(wú)菌水為空白對(duì)照，簡(jiǎn)寫為“水”；待測(cè)單株提取的 DNA 作為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物分別編號(hào)為 1~21，檢測(cè)結(jié)果如下圖 2-3 所示，陽(yáng)性對(duì)照有特異條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均無(wú)條帶，1~21號(hào)全部有特異條帶，并且和質(zhì)粒擴(kuò)增的條帶大小一致，因此可以初步認(rèn)定為該株系的各個(gè)單株全部含有目的基因，即為候選純合株系。圖 2-4 所示，陽(yáng)性對(duì)照有特異條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有條帶，1-21 號(hào)大部分樣品有條帶，但 4、13、14 沒有條帶，說(shuō)明該株系只是后代部分單株含有目的基因，即該株系為雜合株系。以此為標(biāo)準(zhǔn)，將除草劑篩選出的 44 個(gè)株系全部進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，共篩選出了候選純合株系42 個(gè)，雜合株系 2 個(gè)。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3061939