甘草在我國有悠久的藥用歷史,是最常用的大宗藥材之一,具有清熱解毒、補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、祛痰止咳和調(diào)和諸藥的作用。此外,甘草在食品、化妝品及輕工業(yè)等領(lǐng)域亦用途頗廣。由于野生甘草的過度采挖,2000年國務(wù)院明令禁止采挖野生甘草,目前,人工栽培甘草已成為商品甘草的主要來源,然而,本課題組前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),與野生甘草相比,人工栽培甘草普遍存在藥材質(zhì)量偏低的問題,如何提高栽培甘草的質(zhì)量已成為制約甘草資源可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。甘草酸是2015版《中國藥典》規(guī)定甘草藥材的指標(biāo)性成分之一,而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在三基原甘草中光果甘草的甘草酸含量最高,因此光果甘草是研究甘草酸生物合成分子調(diào)控機(jī)制的良好實(shí)驗(yàn)材料。同時(shí),X射線輻照誘變處理具有簡單便捷、突變頻率高、變異范圍廣、打破連鎖遺傳、育種周期短和有益突變高等優(yōu)點(diǎn)。因此,本文在X射線輻照處理光果甘草的基礎(chǔ)上,篩選有效成分含量差異最顯著的光果甘草樣品,利用高通量RNA-Seq測序技術(shù)構(gòu)建差異基因表達(dá)圖譜,篩選甘草酸生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因,并通過構(gòu)建基因過表達(dá)體系對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證,解析甘草有效成分生物合成的分子調(diào)控機(jī)制,為甘草的定向分子育種及優(yōu)良種質(zhì)資源的獲得奠定基礎(chǔ)。本論文采用X射線輻照處理三基原甘草種子,利用HPLC測定甘草樣品18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量,并計(jì)算其產(chǎn)量;篩選出3株高甘草酸含量/產(chǎn)量的輻照光果甘草樣品和1株低甘草酸含量/產(chǎn)量的空白光果甘草樣品,利用RNA-Seq測序得到4個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組信息;通過生物信息學(xué)分析預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本,獲得可變剪切和基因變異位點(diǎn),對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行功能注釋,通過差異表達(dá)分析獲得1736條共有差異表達(dá)基因,通過基因功能富集,篩選出18個(gè)候選關(guān)鍵功能基因;利用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù);并克隆得到了光果甘草的1個(gè)生長素響應(yīng)蛋白基因(Auxin-responsive protein IAA,ARPI)和1個(gè)UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶基因(UDP-glucose 4-epimerase,UGE);成功構(gòu)建了這2個(gè)基因的植物雙元表達(dá)載體,為進(jìn)一步建立過表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。本論文取得的研究結(jié)果如下:(1)X射線輻照處理影響光果甘草三萜類化合物的含量和產(chǎn)量:采用6梯度對(duì)甘草種子進(jìn)行X射線輻照處理,栽培1年后采收根樣,利用HPLC法對(duì)159株甘草樣品中的18α-甘草酸和18β-甘草酸進(jìn)行含量測定,并計(jì)算其產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):X射線輻照處理可顯著提高甘草樣品的生物量,并促進(jìn)其18α-甘草酸和18β-甘草酸的積累。以甘草酸含量和產(chǎn)量為指標(biāo),篩選出3個(gè)高甘草酸含量/產(chǎn)量的光果甘草樣品H1、H2和H3以及1個(gè)低甘草酸含量/產(chǎn)量的空白對(duì)照樣品L1作為轉(zhuǎn)錄組分析的實(shí)驗(yàn)材料。(2)甘草酸差異積累的光果甘草樣品的轉(zhuǎn)錄組分析:通過RNA-Seq首次獲得4個(gè)光果甘草樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),其基因組覆蓋率良好,存在大量可變剪切,共獲得了10149個(gè)新轉(zhuǎn)錄本,存在巨大的新基因挖掘空間,極大豐富了甘草的基因庫,并對(duì)大量結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行了優(yōu)化;在GO和KEGG注釋結(jié)果中,GO數(shù)據(jù)庫注釋了13598個(gè)功能基因,KEGG注釋了9647個(gè)功能基因,共成功注釋16733個(gè)基因,其中鑒定到56個(gè)基因直接參與到甘草酸的生物合成途徑中;通過基因差異表達(dá)分析,L1-H1、L1-H2、L1-H3各得到3955、3906和3478個(gè)差異基因,3個(gè)比較組合的差異基因取并集共得到1376個(gè)核心差異基因,聚類熱圖表明甘草酸高含量/產(chǎn)量的樣本表達(dá)模式一致性良好,均區(qū)別于甘草酸低含量/產(chǎn)量樣本L1;富集分析表明大量基因富集在泛醌和其他萜類醌生物合成途徑、糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷類代謝以及植物晝夜節(jié)律5條代謝途徑中,并從中共篩選到18個(gè)候選關(guān)鍵功能基因:HMGR、CRTZ、GA2ox、AMYB、glgc、PP2C、ARPI、PRR5、DXS、LIS、UGE、VR、I2'H、F3'H、COMT、CHI、F5'H和CHS。(3)候選關(guān)鍵功能基因的相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證:利用qRT-PCR對(duì)18個(gè)候選關(guān)鍵功能基因進(jìn)行驗(yàn)證,與三萜低含量/產(chǎn)量樣本L1相比,在三萜高含量/產(chǎn)量樣本中8個(gè)基因表達(dá)量共同上調(diào),10個(gè)基因表達(dá)量共同下調(diào)。qRT-PCR表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄組測序的變化倍數(shù)的相關(guān)性分析表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。從18個(gè)候選功能基因中進(jìn)一步挑選出生長素誘導(dǎo)蛋白基因ARPI和UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶基因UGE進(jìn)行后續(xù)的基因克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。(4)光果甘草GgARPI基因的克隆及生物信息學(xué)分析:根據(jù)甘草的基因組信息,利用特異性引物成功擴(kuò)增得到長度為686bp的GgARPI基因cDNA序列,包含585bp的開放閱讀框,共編碼194個(gè)氨基酸殘基。生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明光果甘草的ARPI蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的親水蛋白,成功預(yù)測了其二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu),該蛋白不含信號(hào)肽,沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。此外,聚類分析結(jié)果表明不同物種間ARPI序列區(qū)分度良好,GgARPI及其編碼蛋白與豆科植物的親緣關(guān)系最近,進(jìn)化關(guān)系明確。(5)光果甘草GgUGE基因的克隆和生物信息學(xué)分析結(jié)果:根據(jù)甘草的基因組信息,成功擴(kuò)增得到長度為1121bp的GgUGE基因cDNA序列,包含1053bp的開放閱讀框,共編碼350個(gè)氨基酸殘基。生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明光果甘草的UGE蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定的親水蛋白,成功預(yù)測了其二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu),該蛋白不含信號(hào)肽,沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。此外,聚類分析結(jié)果表明不同物種間UGE序列區(qū)分度良好,GgUGE及其編碼蛋白與豆科植物的親緣關(guān)系最近,進(jìn)化關(guān)系明確。(6)光果甘草GgARPI、GgUGE基因植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建:利用Fusion重組酶將目的基因片段和雙酶切后的pCAMBIA1305.1載體連接,構(gòu)建了含甘草GgARPI和GgUGE基因的雙元表達(dá)載體pCA-GgARPI和pCA-GgUGE,并將其保存在大腸桿菌中。通過PCR及測序驗(yàn)證,確保插入基因的完整性以及載體的成功構(gòu)建,為后續(xù)的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S567.71
【部分圖文】：

目前甘草酸的生物合成途徑己基本闡明，即：通過甲羥戊酸（Ｍｅｖａｌｏｎｉｃ?ａｃｉｄ，??ＭＶＡ）途徑和甲基赤蘚醇憐酸途徑（Ｍｅｔｈｙｌ?ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ?ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＥＰ）合成甘??草酸，如圖１所示，該途徑受多種酶的調(diào)控，其代謝流平衡受到多種基因的制約。??此外，植物體內(nèi)存在多條代謝途徑，次生代謝和初生代謝關(guān)系如圖２所示，代謝??途徑之間通過節(jié)點(diǎn)相互聯(lián)系，形成一個(gè)相互影響的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可見，甘草酸??的含量不僅受自身代謝途徑的影響，還受到代謝網(wǎng)絡(luò)中其他代謝途徑的影響。項(xiàng)??１２??

ＭＶＡ）途徑和甲基赤蘚醇憐酸途徑（Ｍｅｔｈｙｌ?ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ?ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＥＰ）合成甘??草酸，如圖１所示，該途徑受多種酶的調(diào)控，其代謝流平衡受到多種基因的制約。??此外，植物體內(nèi)存在多條代謝途徑，次生代謝和初生代謝關(guān)系如圖２所示，代謝??途徑之間通過節(jié)點(diǎn)相互聯(lián)系，形成一個(gè)相互影響的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可見，甘草酸??的含量不僅受自身代謝途徑的影響，還受到代謝網(wǎng)絡(luò)中其他代謝途徑的影響。項(xiàng)??１２??

圖３技術(shù)路線流程圖??１６??
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