【摘要】：大豆是世界上重要的油料作物,我國又是大豆油消費大國。但由于我國大豆種子含油量較低,不能自給自足,很大程度上依賴進口。因此,培育高油大豆新品種成為解決問題的主要途徑。傳統(tǒng)育種手段由于工作量大、周期長、效率低等缺點不能滿足農業(yè)生產對于高油大豆的需求。隨著近些年基因工程與分子育種水平的飛速發(fā)展,通過轉基因技術獲得高油大豆種質資源成為最主要的研究方式。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn),WRI1轉錄因子可以調控種子脂肪酸合成,是油脂合成路徑中的重要調節(jié)因子。而且,本實驗前期從大豆中分離了大豆GmWRI1基因,并將其轉入受體DN50中,結果表明,轉基因大豆種子的油分含量顯著提高。為了進一步篩選目標性狀突出,且具有重要育種應用價值的高油轉基因大豆株系,本研究以本實驗室已獲得的T3代轉GmWRI1a基因大豆6個株系的植株為試驗材料,在基因水平和蛋白水平,對轉基因大豆進行了分子水平檢測。并對轉基因大豆植株進行了種子含油量、蛋白質含量等品質性狀、農藝性狀和對非靶標生物的抗性以及基因漂移等進行了分析。研究結果主要如下:(1)利用130mg/L的草銨膦涂抹、RCR擴增和Southern blot檢測方法對轉GmWRI1a基因大豆株系進行篩選鑒定,證明轉GmWRI1a基因的大豆株系能夠穩(wěn)定遺傳并且Bar基因以寡拷貝和多拷貝的形式插入到受體基因組中。(2)利用Western blot技術檢測外源Bar蛋白在轉基因大豆中的表達,結果證明Bar蛋白在轉基因大豆中得到了表達。(3)對過表達GmWRI1a基因大豆種子的油分和蛋白質含量進行測定,證明高油性狀可以穩(wěn)定遺傳,但蛋白質含量降低。(4)對過表達GmWRI1a基因大豆農藝性狀進行調查,結果表明過表達GmWRI1a基因大豆株系和對照DN50相比,出苗率、生育期以及其他農藝性狀指標未發(fā)現(xiàn)顯著差異,但部分株系的株高、主莖節(jié)數(shù)和分枝數(shù)發(fā)生顯著變化,說明GmWRI1a基因過量表達可能對轉基因植株的株高、節(jié)數(shù)和分枝數(shù)造成影響。(5)對轉GmWRI1a基因大豆植株進行基因漂移鑒定,檢測結果顯示,在距離種植區(qū)域50m以內未發(fā)現(xiàn)基因漂移現(xiàn)象。(6)對過表達GmWRI1a基因大豆植株的菌核病、小菜蛾、食心蟲非靶標病蟲害抗性進行鑒定,結果表明,轉基因大豆植株與對照DN50植株一致,對非靶標病蟲害不具有抗性。(7)對過表達GmWRI1a基因大豆種子的品質性狀進行測定。結果表明,轉基因大豆種子的可溶性還原糖、淀粉、纖維素、水分、灰分含量和對照DN50之間不具有明顯差異,但部分株系的脂肪酸組成差異性顯著,表現(xiàn)為硬脂酸的含量升高。
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S565.1
【圖文】：

技術路線圖

東北農業(yè)大學農業(yè)碩士學位論文與分析達 GmWRI1a 基因大豆植株檢測表達 GmWRI1a 基因大豆植株草銨膦抗性檢測因作為篩選標記基因，與 GmWRI1a 基因通過 T-DNA 插入同時導入因此使轉基因大豆同時具有草銨膦抗性。大豆幼苗期對其進行草銨膦因大豆株系的初步篩選工作。待大豆植株第一個三出復葉長大后，銨膦對其最嫩的葉片進行涂抹，3-5 天后觀察葉片的變化。結果顯示，，其他轉基因株系中均存在具有草銨膦抗性的植株，即葉片沒有發(fā)生3-1），可以初步認定為是轉基因的大豆植株。

er；+：陽性質粒；-：對照 DN50；1-6：DN50-352、DN50-356、DN50-118、DN50-351、DN50-36DN50-3 株系的轉基因陽性植株圖 3-2 35S+Bar 基因 PCR 檢測結果Fig.3-2 Detection results of 35S+Bar gene by PCR過表達 GmWRI1a 基因大豆植株的 Southern blot 檢測了確定目的基因已插入到大豆基因組中，本研究利用 Bar 基因制作特異性探針進n 雜交鑒定。利用 CTAB 高鹽法提取大量且質量較高的 DNA，基因組經過 HindIII 0.8%的瓊脂糖凝膠對酶切產物進行分離，轉膜后利用 Bar 特異性探針雜交，并顯色示，泳道 2 和 3 植株有兩條帶，泳道 4、5 和 6 有三條帶，泳道 1 號有四條帶（圖 3-3源基因以寡拷貝和多拷貝的形式插入到了大豆 DN50 基因組中。

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本文編號：2781692