【摘要】：表觀遺傳學(xué)的主要研究內(nèi)容包括DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑因子等。組蛋白修飾是指組蛋白N末端氨基酸殘基上的各種修飾,如甲基化、乙�；土姿峄�。這些修飾能夠通過影響染色質(zhì)狀態(tài),從而調(diào)控基因的表達,是表觀遺傳調(diào)控的重要機制之一。組蛋白乙�；茄芯勘容^多的一種修飾,組蛋白乙�；奶砑雍腿コ謩e是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)調(diào)控。組蛋白去乙�；缚煞譃槿齻�亞家族:RPD3/HDA1家族、HD2家族和SIR2家族。本實驗室前期研究表明,水稻SIR2家族組蛋白去乙�；窸sSRT1通過對糖酵解途徑中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(OsGAPDH1)去乙酰化,進而抑制其轉(zhuǎn)錄活性,并且OsSRT1還抑制了OsGAPDH1蛋白在細胞核內(nèi)的積累,從而調(diào)控糖酵解代謝,最終影響水稻植株體內(nèi)的能量代謝。為了研究其它組蛋白去乙酰化酶是否與能量代謝相關(guān),我們以RPD3/HDAI家族中兩個組蛋白去乙�；窸sHDA706和OsHDA714為對象,通過反向遺傳學(xué)、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等方法來研究OsHDA706和OsHDA714的生物學(xué)功能及其參與的代謝途徑,試圖闡明其在水稻生長發(fā)育、基因表達以及代謝調(diào)控中的作用機理。本研究的主要結(jié)果如下:1.OsHDA706和OsHDA 714的表達譜分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因在水稻的成熟葉、劍葉以及莖桿等組織部位表達量較高,而在愈傷、胚乳和幼穗等組織中的表達量低。通過基因表達節(jié)律性分析發(fā)現(xiàn)OsHDA706有一定的晝夜節(jié)律性,而OsHDA714沒有晝夜節(jié)律性。2.利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)建了OsHDA 706和OsHAD714突變體材料。表型考察發(fā)現(xiàn)hda706的種子表現(xiàn)出提前成熟的表型,超量表達植株(OA706)表現(xiàn)出植株變矮和分蘗減少的表型;而OsHDA714的突變體植株(hda714)表現(xiàn)出種子結(jié)實率變低,植株株型更緊湊的表型,而超量表達植株(OX714)未發(fā)現(xiàn)明顯表型。3.亞細胞定位軟件預(yù)測OsHDA706和OsHDA714蛋白位于細胞質(zhì)。通過原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化和煙草瞬時表達實驗證實OsHDA706定位于在細胞質(zhì)中,OsHDA714同時定位于細胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。這說明水稻中組蛋白去乙�；傅暮速|(zhì)分布不具有細胞特異性,并且為代謝酶乙酰化調(diào)控代謝酶的酶活機制提供了證據(jù)。4.通過對野生型水稻材料進行不同的脅迫處理,檢測OsHDA706和OsHDA714的表達水平,結(jié)果顯示在300 mM NaCl和熱脅迫(42℃)處理下,OsHDA706的表達上升,而在冷脅迫(4)處理時,OsHDA706的表達受到了抑制。而OsHDA 714不受 NaCl(300 mM)、熱脅迫(42℃)、PEG6000(20%)和 Mannitol(200 mM)等逆境脅迫的誘導(dǎo)表達。5.對野生型水稻材料進行能量脅迫處理,檢測OsHDA706和OsHDA714的表達水平,結(jié)果顯示除2%葡萄糖(Glucose)處理外,在暗處理和缺氮培養(yǎng)液處理下,OsHDA706的表達水平均上升。在2%Glucose和缺氮的能量脅迫處理下,OsHDA714表達量變化不大,但暗處理9h后OsHDA 714的表達受到了抑制。通過hda706和hda714突變體植株進一步驗證了上述結(jié)果。因此說明OsHDA706的表達受碳(黑暗)和氮(完全缺氮)能量相關(guān)處理的誘導(dǎo)。6.通過酵母雙雜交實驗,分別篩選到兩個與OsHDA706和OsHDA714產(chǎn)生互作的蛋白——烯酰輔酶A水合酶(ECH)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)。此外,通過亞細胞定位的結(jié)果表明OsHDA706、OsHDA714分別與互作蛋白ECH和G6PDH共定位。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S511;Q943.2
【圖文】：

ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（Ｌｅｉ邋ｅｔ邋ａｌ邋２０１４；邋Ｌｉｕ邋ｅｔ邋ａｌ邋２０１７）。將目的基因的基因組序列或編碼區(qū)序列逡逑復(fù)制到網(wǎng)站首頁，執(zhí)行搜索功能，在靠近基因編碼區(qū)序列的５＇端，選擇可能的逡逑脫靶位點最少且Ｓｃｏｒｅ的分值最高的點作為靶位點，并設(shè)計引物（圖２Ａ）。以逡逑Ｕ３啟動子構(gòu)建的Ｔ－Ａ克隆質(zhì)粒為模板和引物ＯｓＵ３－Ｆ／ＨＤＡ７０６ＣＲＰ－Ｒ、逡逑ＨＤＡ７０６ＣＲＰ－Ｆ＋ＯｓＵ３－Ｒ、ＯｓＵ３－Ｆ／ＨＤＡ７１４ＣＲＰ－Ｒ、ＨＤＡ７１４ＣＲＰ－Ｆ＋ＯｓＵ３－Ｒ邋進行逡逑ＰＣＲ反應(yīng)。將對應(yīng)基因的ＰＣＲ產(chǎn)物切膠純化回收，兩兩混合作為模板（圖２Ｂ），逡逑使用引物ＯｓＵ３－Ｆ／ＯｓＵ３－Ｒ進行下一輪ＰＣＲ反應(yīng)。構(gòu)建Ｔ－Ａ克隆的中間載體，最逡逑后篩選含有８１１ｂｐ外源片段的正確陽性克隆。再使用沒ｗｌ酶切克隆質(zhì)粒，最后逡逑連接到用你》１酶切開的ｐＣＸＵＮ－Ｃａｓ９載體上，篩選含有外源片段的陽性克隆。逡逑１４逡逑

（＾／／幾４７收卻僅有１個外顯子（表１）。對本研宄中ＲＰＤ３／ＨＤＡ１超家族基因的逡逑結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果顯示ａ５／／ＺＸ４７你和都包含有一個去乙�；腻义辖Y(jié)構(gòu)域（圖３）。逡逑ＯＳＨＤＡ７０６邋邐１邐邐：］—逡逑ＯｓＨＤＡ７１４邋－￣￣Ｉ邐ＺＨ－逡逑Ｉ邐￣１邋ＨＤＡＣ邋ｄｏｍａｉｎ邋■邋Ｌｏｗ邋ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ逡逑圖３．邋ＯｓＨＤＡ７０６和ＯｓＨＤＡ７１４的結(jié)構(gòu)域逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｔｈｅ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｏｆ邋ＯｓＨＤＡ７０６邋ａｎｄ邋ＯｓＨＤＡ７１４逡逑２２逡逑

２－邐Ｆｌ邐Ｉ邋0５＿逡逑Ｖ贊梊＃邐ｖ邋烱

本文編號：2775220