【摘要】：高產(chǎn)是甘藍型冬油菜諸多優(yōu)點之一,但由于抗寒性差,難以適應我國北方地區(qū)冬季惡劣的氣候條件而越冬困難。甘藍型冬油菜品種間抗寒性及越冬性方面存在較大差異,這些差異不僅表現(xiàn)在形態(tài)等方面,也表現(xiàn)在生理生化及感溫性等方面。因此,研究不同抗寒性甘藍型冬油菜對低溫環(huán)境的適應性具有重要的現(xiàn)實意義。本研究以13個不同抗寒性甘藍型冬油菜為試驗材料,采用生理生化常規(guī)檢測方法和甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術(shù),分別對其低溫脅迫后的抗寒性指標和DNA甲基化水平及模式進行了檢測,同時采用同源基因克隆和實時熒光定量PCR技術(shù),對LOC111212830和At4g02000-like蛋白進行了克隆和分析,主要結(jié)果如下:1.低溫處理后,不同抗寒性甘藍型冬油菜的SOD、POD和CAT活性,均有一定程度的升高,并且抗寒性較強品種的增加幅度較抗寒性較弱品種明顯,其中抗寒性較弱品種SOD、POD和CAT活性增幅,分別在28.96-71.49 U/g、27.54-77.46 U/g、11.72-16.48U/g之間,而抗寒性較強品種,分別在67.87-129.11 U/g、86.54-131.57 U/g、22.19-43.88U/g之間。2.低溫處理后,不同抗寒性甘藍型冬油菜的MDA、SP和Pro含量也有一定程度的升高,其中抗寒性較強品種的SP和Pro含量的增加幅度明顯比抗寒性較弱品種高,但其MDA含量的增加幅度卻明顯低于抗寒性較弱品種,其中抗寒性較弱品種MDA、SP和Pro的增幅,分別在3.22-10.47μmol/g、3.00-7.96 mg/g、1.63-124.73μg/g之間,而抗寒性較強品種,分別在0.58-3.22μmol/g、9.90-21.43 mg/g、113.76-271.58μg/g之間。3.不同抗寒性甘藍型冬油菜DNA甲基化水平存在較大差異。常溫處理下,參試材料中抗寒性較弱品種甲基化水平在19.05%-55.56%之間,抗寒性較強品種在20.29%-59.57%之間;低溫處理下,抗寒性較弱品種甲基化水平在45.33%-73.68%之間,抗寒性較強品種在18.18%-56.63%之間;較常溫處理,14美切實07、14美切實16、14美切實20、14美切實3和美切實38等抗寒性較弱品種低溫處理后的甲基化水平分別升高了25.53%、18.13%、26.29%、17.98%、1.27%,而14NS54-1、15TS306、14NS52-3、15TS309、14NS54-7、15TS312、TSG10(秦川)和TSG10(天水)等抗寒性較強品種分別降低了0.19%、22.88%、15.77%、7.36%、2.95%、0.36%、5.32%、2.11%。4.低溫處理后,15TS306、14NS52-3、15TS309、14NS54-7和15TS312等抗寒性較強品種以去甲基化模式為主,而14美切實07、14美切實16、14美切實20、14美切實3和美切實38等抗寒性較弱品種以甲基化模式為主。5.以13個抗寒性不同的甘藍型冬油菜總RNA為模板,利用E86Msp32和E1Msp36兩對引物進行DNA甲基化特異片段的克隆、測序和比對,結(jié)果表明:有16條片段序列與已知和假定功能的酶及蛋白具有較高的相似性,并對相似性較高且功能未知的甘藍型油菜LOC111212830和At4g02000-like進行了克隆及分析,結(jié)果表明,LOC111212830開放閱讀框長1107bp,等電點為8.88,相對分子質(zhì)量為43.6k D,不穩(wěn)定指數(shù)為51.87,平均親水指數(shù)為-0.281;而At4g02000-like開放閱讀框為1020bp,等電點為9.20,相對分子質(zhì)量為39.9k D,不穩(wěn)定指數(shù)為47.60,平均親水指數(shù)為-0.437;14美切實07、美切實38、15TS306、15TS309、15TS312和TSG10(秦川)等6個不同抗寒性甘藍型冬油菜品種中的LOC111212830同源性達97.76%;At4g02000-like同源性達97.17%。6.低溫處理后,LOC111212830和At4g02000-like在14美切實07、美切實38、15TS306、15TS309、15TS312和TSG10(秦川)等6個甘藍型冬油菜品種中的表達量存在顯著差異,其中LOC111212830保守序列在抗寒性較弱品種中表達量下調(diào),在抗寒性較強品種中表達量則為上調(diào),其特異序列在抗寒性較強品種中的表達量也為上調(diào),但在抗寒性較弱品種中的表達量卻有所不同;而At4g02000-like保守序列在抗寒性較弱品種中表達量下調(diào),在抗寒性較強品種中表達量則為上調(diào),At4g02000-like其特異序列在抗寒性較弱和抗寒性較強品種中表達量均為上調(diào)。綜上所述,低溫脅迫下,抗寒性較強品種的抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著高于抗寒性較弱的品種,但MDA含量顯著低于抗寒性較弱品種;甲基化模式和去甲基化模式同時存在于甘藍型冬油菜基因組DNA中,其中抗寒性較弱品種甲基化水平升高,以甲基化模式為主;抗寒性較強品種甲基化水平降低,以去甲基化模式為主;LOC111212830和At4g02000-like在不同抗寒性甘藍型冬油菜中的相對表達量與各參試材料的甲基化模式有關(guān)。
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S565.4
【圖文】：

染色質(zhì)域甲基轉(zhuǎn)移酶 CMT3 和組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 KYP 相互協(xié)同維持，而非對稱 C位點的甲基化則由 RdDM 途徑來維持，該途徑 DNA 甲基化的建立是通過一條依SiRNA 的甲基化途徑來實現(xiàn)的（圖 1）[59]，首先由植物特有 RNA 聚合酶 PolⅣ、切DCL3 以及聚合酶 RDR2 協(xié)同調(diào)控作用下產(chǎn)生 SsRNA，SsRNA 加載進入 AG04 和 AG通過從頭合成 DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶 DRM2 來指導甲基化發(fā)生[60]，然后在 PolIV 的相用蛋白 CLSY1 和 DTF1 的幫助下使得 PolIV 定位到組蛋白 H3 上[61]，最后 SUVH2過與 PolV 的相互作用蛋白復合體 DMS3/DRD1/RDM1（DDR）結(jié)合對 PolV 已經(jīng)招的且具有較低程度的 DNA 甲基化位點進行介導[62-65]。當 CHH 甲基化的靶位點被建低程度的 DNA 甲基化之后，PolIV 和 RDR2 產(chǎn)生的雙鏈 RNA 轉(zhuǎn)錄本將被 DCL3 切生 24nt 的SiRNA，通過經(jīng)典的依賴于 SiRNA的途徑加強 CHH 甲基化，而 PolIV 和 R產(chǎn)生的單鏈 RNA 轉(zhuǎn)錄本將結(jié)合 AGO4，并被 RNA 外切酶削減呈梯度分布的 20-60SiRNA，這些 SiRNA 不依賴于 DCL 蛋白產(chǎn)生，但對 CHH 甲基化水平的提高同樣促進作用[66-67]。

生素篩選板上，37℃過夜。1.6.3 菌落 PCR 與測序[143]用白色槍頭挑取陽性克隆，置于含 Amp 的 2mL LB 液中，37℃ 200rpm 取 5μl 菌液，以選擇性擴增的 PCR 反應體系，預擴增 PCR 程序進行擴增，擴增1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測出的相應片段大小的菌液送至生工技術(shù)有限2 結(jié)果與分析2.1 總 DNA 提取與預擴增結(jié)果檢測利用 1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的 13 個抗寒性不同的甘藍型冬油菜總 D進行檢測，結(jié)果表明，主帶較亮且未拖尾現(xiàn)象（圖 3-2），說明所提 DNA 質(zhì)量用于 MSAP 分析試驗。預擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其呈彌散狀態(tài)（圖 3-雙酶切、接頭復性和連接反應等試驗體系及程序正常，可用以選擇性擴增反應15TS30614Meiqieshi315TS312 Meiqieshi3814NS54-714Meiqieshi0714NS54-1TSG10(Qinchuan)14NS52-3 15TS30914Meiqieshi20

B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M 分別表示 14 美切 07、14 美切實 16、14 美切實 20、14 美切實 34NS52-3、15TS309、14NS54-7、15TS312、TSG10（秦川）和 TSG10（天水）；Marker 為 DL2000。C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M represent 14Meiqieshi07、14 Meiqieshi16、14 Meiqieshi20、14 M5TS306、14NS52-3、15TS309、14NS54-7、15TS312、TSG10(Qinchuan) and TSG10(Tianshui); Marker圖 3-3 部分參試材料預擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3-3 Electrophoresis diagram of the pre-amplification product of some test脅迫下參試材料 DNA 甲基化水平變化 12 對引物組合對 13 個參試材料低溫處理前后的葉片基因組 D到參試材料低溫處理前后的甲基化水平如表 3-3 和圖 3-4 所示中抗寒性較弱品種 14 美切實 07、14 美切實 16、14 美切實 2038 的甲基化水平在 19.05%-55.56%之間，抗寒性較強品種 14NS-3、15TS309、14NS54-7、15TS312、TSG10（秦川）和 TSG10 20.29%-59.57%之間；低溫處理下，抗寒性較弱品種甲基化水平寒性較強品種甲基化水平在 18.18%-56.63%之間。比較分析發(fā)常溫處理下甲基化水平差異不明顯（1.24%-4.01%），而在低溫

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本文編號：2757140