【摘要】：近年來,由于生產(chǎn)水平的提高和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化,以及人們膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整,甘薯(Ipomoea batatas L.)作為重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新能源,種植的面積日益加大,人們對甘薯的需求也日益增高。甘薯是一種無性繁殖作物,極易在代代繁殖中累積病毒,從而導(dǎo)致產(chǎn)量大減,品質(zhì)變差。深入研究甘薯抗病機(jī)制,可以為甘薯的優(yōu)質(zhì)育種提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,篩選出一些與甘薯抗病毒病相關(guān)的基因,其中包括SPW5基因。本研究從甘薯品種徐薯22中克隆出了SPW5基因,并對其核苷酸序列進(jìn)行了分析,證明SPW5屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子,成功構(gòu)建了該基因過表達(dá)載體SPW5-p101-GV3101。對甘薯的再生體系進(jìn)行了探索:以無菌試管苗為材料,分別將4個(gè)甘薯品種的莖尖、葉片、葉柄、側(cè)芽作為外植體建立再生體系,并對離體再生培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,成功誘導(dǎo)出愈傷組織,并進(jìn)行懸浮培養(yǎng),成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。并且對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的SPW5基因表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了探索。主要研究結(jié)果如下:1.基因克隆及載體構(gòu)建:根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的序列設(shè)計(jì)SPW5基因引物,從甘薯品種徐薯22中克隆了SPW5基因CDS序列。然后利用載體pEarleyGate101成功構(gòu)建了超表達(dá)載體SPW5-p101-GV3101。2.生物信息學(xué)分析:利用生物信息學(xué)技術(shù)對SPW5基因進(jìn)行預(yù)測分析,編碼區(qū)1182bp,編碼了393個(gè)氨基酸,該基因編碼的蛋白是一個(gè)位于細(xì)胞核的非膜蛋白,蛋白質(zhì)分子量為43301.21 Da,等電點(diǎn)pI為6.36,通過NCBI網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)編碼的蛋白具有WRKY家族所有的WRKY區(qū)域,且具有高度的保守性,推斷甘薯SPW5基因編碼WRKY家族基因的成員。3.甘薯再生體系的試驗(yàn)結(jié)果表明:(1)甘薯誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)最佳的外植體是葉片;(2)在甘薯愈傷組織培養(yǎng)中,MS+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖的效果最好;(3)懸浮培養(yǎng)的最佳條件是:初始接種密度在1.0-4.0:25mL范圍內(nèi)時(shí),隨著接種密度增大,懸浮細(xì)胞的增值速率逐漸變小,因此最佳的接種密度為1.0:25ml。初始接種量在0.5-2.0mL范圍內(nèi)時(shí),隨著接種量的增加,懸浮細(xì)胞的增值速率呈下降趨勢,綜合考慮絕對增值量,最佳的接種量為1.5mL。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為低于100r/min時(shí),胚性懸浮細(xì)胞的增值速率隨著轉(zhuǎn)速的增加而加大,反之,當(dāng)轉(zhuǎn)速高于100r/min時(shí)則相反,因此最佳的搖床轉(zhuǎn)速為100r/min。4.對甘薯遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了探索,結(jié)果表明,用甘薯品種徐薯22作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體時(shí),(1)非轉(zhuǎn)基因陽性植株在50mg/L卡那霉素(Kan)的條件下依然能正常生長發(fā)育,因此在遺傳轉(zhuǎn)化過程中需提高抗性篩選濃度。(2)不帶側(cè)芽的莖段并不能分化出不定芽,而帶有側(cè)芽的莖段一共分化出45株擬轉(zhuǎn)基因植株,PCR結(jié)果表明,45個(gè)植株中,并未出現(xiàn)陽性植株。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S531
【圖文】：

RKY 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物防御病原菌脅迫時(shí)，既有正向調(diào)控又有負(fù)芥 AtWRKY8，AtWRKY28 正向調(diào)控植物對灰葡萄孢菌(Botrytis cine，缺少 AtWRKY70 將使得植物易感染灰霉病菌、葉斑病菌和真菌性AtWRKY48 負(fù)調(diào)控植物對丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的抗KY70 是小麥抗條銹病的正調(diào)控因子。水稻 OsWRKY45 有兩個(gè)等位基自粳稻的 OsWRKY45-1 和來自秈稻的 OsWRKY45-2，它們都是水稻調(diào)控因子。但兩者對其他病害的調(diào)節(jié)能力卻有所不同，前者的過表稻對白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的抗性減弱，而后者則增強(qiáng)水稻o et al.，2009)。一個(gè) WRKY 轉(zhuǎn)錄因子(SPF1)是 1994 年從甘薯(Ipomoea batatas.L)發(fā)蔗糖的調(diào)控，而后逐漸在其他作物上發(fā)現(xiàn)其他 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，至 700 多個(gè)，其中擬南芥有 74 個(gè)，水稻 109 個(gè)，大豆 182 個(gè)，玉米 11由于復(fù)雜的遺傳背景和較大的基因組，在此方面的研究并不多見，于其他作物的研究基礎(chǔ)，對甘薯抗病相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行探

第 2 章 甘薯 SPW5 基因克隆及生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)，正向引物和反向引物分別是 F：5’-cgcagcagcccagccaagaaagatatatga-3’，R3’-atggagaacaaatttgatgacctcatcat-5’，預(yù)計(jì)克隆的基因片段為 1182bp，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖 2-1a)，擴(kuò)增后產(chǎn)物連接 TOPO-pENTR 載體，轉(zhuǎn)大腸桿菌感受態(tài) DH5 ，涂 LB+Kan 抗性平板，37°C 培養(yǎng) 13-16h 出現(xiàn)單菌落，擇 12 個(gè)單菌落在 LB+Kan 液體培養(yǎng)基中搖菌，200r/min 過夜培養(yǎng)，然后采用擴(kuò)引物進(jìn)行 PCR 檢測(圖 2-1b)并送測序。電泳檢測與目的片段大小相同，測序結(jié)序列與目的序列對比相同，則表明成功克隆了該基因。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2742107