【摘要】：小黑麥(Triticale)是由小麥屬(Triticum)和黑麥屬(Secale)通過屬間有性雜交和雜種染色體數(shù)加倍相結(jié)合的新物種。小黑麥籽粒的顏色多樣,其中藍色籽粒是由于糊粉層中富含花青素形成的,而藍粒性狀又可作為一種特殊的遺傳標記,具有實際的育種價值,然而其分子遺傳機理目前尚不清楚。本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析藍白色糊粉層中與花青素合成代謝通路有關(guān)的基因的表達水平,尋找差異表達基因,篩選出調(diào)控小黑麥糊粉層花青素合成的候選基因。利用生物信息學(xué)分析候選基因生物學(xué)特征,分離克隆候選基因,利用瞬時表達對其進行功能驗證,主要研究結(jié)果如下:1、將小黑麥藍色和白色糊粉層進行轉(zhuǎn)錄組測序,得到藍粒糊粉層原始數(shù)據(jù)11.08Gb,白粒9.74Gb,Trinty拼接得到有效數(shù)據(jù)20.82Gb,基因平均長度為1683bp,共計73886個unigenes,蛋白同源比對表明小黑麥糊粉層中的蛋白與節(jié)節(jié)麥同源性最高,其次是大麥和小麥;和白粒相比,藍粒糊粉層中表達量上調(diào)的unigenes有7588個,下調(diào)的unienes有25319個。GO功能分類中與次生代謝有關(guān)的unigenes有808個;KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)花青素生物合成約有100個差異unigenes;利用花青素合成代謝通路中的結(jié)構(gòu)基因篩選出86個同源基因,其中藍粒中花青素合成代謝通路中結(jié)構(gòu)基因大多數(shù)高于白粒,說明藍粒中花青素生物合成通路被激活。此外篩選得到2個MYC和2個MYB轉(zhuǎn)錄因子,MYC轉(zhuǎn)錄因子Unigene5672_All(BcMYC1)在藍粒中的表達量是白粒的42倍MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene12228_All在藍粒中的表達量是白粒的2倍。在MYC轉(zhuǎn)錄因子Unigene5672_All(BcMYC1)中白粒表達下調(diào),而MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene12228_All中白粒有表達,故篩選MYC轉(zhuǎn)錄因子BcMYC1作為調(diào)控藍粒糊粉層花青素合成代謝的候選基因。2、BcMYC1基因CDS序列1683bp,編碼560個氨基酸。利用ExPaSy-Prot param軟件分析結(jié)果顯示分子量為61870Da,等電點4.71,不穩(wěn)定指數(shù)為50.58,脂肪指數(shù)78.71。親水性系數(shù)-0.400,說明BcMYC1蛋白具備親水性功能。根據(jù)SOPMA軟件分析得到BcMYC1基因的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(39.64%)、不規(guī)則盤繞(43.93%)、延伸鏈(11.96%)和β-轉(zhuǎn)角(4.46%)。使用TMHMM-2.0軟件分析顯示BcMYC1蛋白質(zhì)不通過跨膜區(qū)并作用于膜外。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)BcMYC1蛋白與小麥、矮牽牛、水稻等物種中調(diào)控花青素生物合成代謝相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子聚為一類,說明BcMYC1與bHLH轉(zhuǎn)錄因子同源。氨基酸比對顯示BcMYC1蛋白與控制小麥藍粒性狀主效基因ThMYC4E和控制紫粒小麥紫粒性狀主效基因T aMYC1在氨基酸序列中都含有bHLH-MYC_N domain、HLH domain和ACT-li ke domain,由此推測BcMYC1很有可能也是一個具有調(diào)控花青素生物合成的功能基因。RT-PCR定量分析,BcMYC1基因在藍粒中表達含量比白粒要高。利用Gateway克隆技術(shù),構(gòu)建瞬時表達載體pBract214:BcMYC1。以bHLH轉(zhuǎn)錄因子ZmR做對照,利用基因槍瞬時介導(dǎo)將表達載體pBract214:BcMYC1與MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmC1混勻后一起轟擊到小麥白色的胚芽鞘中,在小麥白色Opata的胚芽鞘中產(chǎn)生數(shù)個紅色細胞,而單獨轟擊pBract214:BcMYC1、ZmR和ZmC1均無法誘導(dǎo)胚芽鞘產(chǎn)生紅色細胞,由此證明BcMYC1是具有調(diào)控花青素生物合成的功能。
【學(xué)位授予單位】：青海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S512.4
【圖文】：

花青素的結(jié)構(gòu)是 3,5,7-羥基-2-苯基苯并吡喃（圖1-1），根據(jù)花色素苷結(jié)構(gòu)中 R1 和 R2 碳位上的取代基不同，可獲得多種花青素。在自然界中有超過 250 種花青素，屬于 27 個科、73 個屬。有 6 種比較常見，即磚紅色天竺葵色素（Pelargonidin）、紅色矢車菊色素（Cyanidin）、紫紅色芍藥花色素（Peonidin）、藍色飛燕草色素（Delphinidin）、紫色牽�；ㄉ兀≒etunidin）和藍紫色錦葵色素（Malvidin）。花青素分子具有共扼性質(zhì)并含有酸、堿基。它可以大幅度的吸收可見光與紫外光�；ㄇ嗨氐念伾S pH 值變化而變化，pH=7呈紅色，pH=7～8 時呈紫色，pH＞11 時呈藍色[6]。圖 1-1 花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure.1-1 Chemical structure of anthocyanins1.2.2 花青素的生物學(xué)功能植物葉片中積累的花青素通過理化特性來抵御光能危害

圖 2-1 黑飼麥 1 號(藍)和 SHW31(白)種子 2-1 Seeds of Black fodder wheat No.1(Blue)and SHW31(Whi器、試劑

【參考文獻】

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本文編號：2717949