【摘要】：衰老是植物界普遍存在的一種自然現(xiàn)象,在植物整個生命周期中扮演著至關重要的角色,具有重要的生物學意義。植物在適應外界環(huán)境的過程中,蛋白磷酸酶調控多個蛋白激酶的可逆磷酸化過程來使植物適應外界環(huán)境。2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是一類廣泛存在于植物中的蛋白磷酸酶,通過脫磷酸化調控細胞的生長發(fā)育以及信號傳遞,從而調整體內相關基因的變化來對抗逆境脅迫。在前期研究中篩選出兩個PP2C型蛋白磷酸酶編碼的水稻基因OsSAPP2、OsSAPP3,獲得相應的過表達轉基因水稻,并獲得相應的突變體。在本研究主要對水稻OsSAPP2和OsSAPP3功能進行分析。1.蛋白定位本試驗構建了目標蛋白與EGFP的融合蛋白瞬時表達載體。通過對水稻原生質體進行亞細胞定位分析,結果顯示OsSAPP2-GFP和OsSAPP3-GFP融合蛋白均定位于細胞膜上。2.OsSAPP2基因功能運用GUS組織化學染色法對Pro_(OsSAPP2)-GUS轉基因植物中OsSAPP2啟動子活性進行時空表達模式分析。研究結果得出,OsSAPP2基因在轉基因水稻不同發(fā)育時期的葉、根、穗、莖等植物組織部位中均有活性。本試驗對OsSAPP2啟動子序列進行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)其含有激素響應元件,推測其可能響應多種植物激素。試驗結果也得出Pro_(OsSAPP2)-GUS轉基因水稻可以對外源激素處理發(fā)生響應,外源施加同樣濃度的ABA、ACC、SA和SL等激素可以顯著促進Pro_(OsSAPP2)-GUS的表達,而施加相同濃度的6-BA、IAA和GA_3等激素則顯著抑制Pro_(OsSAPP2)-GUS的表達;而施加相同濃度的JA和BR的影響不明顯。本研究結果發(fā)現(xiàn)35S-OsSAPP2轉基因水稻表現(xiàn)出葉面積和有效分蘗減小、抽穗提前以及光合指標和葉綠素含量降低,葉綠體結構發(fā)生異常,葉片比對照提前黃化早衰,葉綠素含量檢測結果與表型相對應等早衰表型。還發(fā)現(xiàn)35S-OsSAPP2轉基因水稻的穗重顯著增加,但穗長顯著減少,一次枝梗和二次枝梗中枝梗數(shù)、實粒數(shù)以及實粒重增加、但同時秕粒也增加,結實率下降,種子的粒寬和粒長增加,千粒重增加。對35S-OsSAPP2轉基因水稻進行稻米品質的測定得到的結果35S-OsSAPP2轉基因水稻在食味值和直鏈淀粉含量上要低于對照。結合前期實驗過程中觀察到的早衰表型變化,利用熒光定量RT-PCR檢測轉基因植物的分子機制變化發(fā)現(xiàn),隨著水稻葉片的衰老35S-OsSAPP2轉基因水稻中衰老相關因子NAP基因和葉綠素降解相關基因PAO、NYC的表達量上調,且隨著衰老的加劇表達量是升高的,光合作用相關基因PSaA、PSbA從抽穗期開始表達量下降。葉綠素合成相關基因CAO在蠟熟期時表達量降低。3.OsSAPP3基因功能經過外源誘導后的GVG-OsSAPP3轉基因水稻同樣表現(xiàn)早衰表型:光合指標降低,葉綠素含量降低、葉片比對照提前黃化早衰,葉綠體結構發(fā)生異常,葉綠素含量檢測結果與表型相對應。結合前期實驗過程中觀察到的早衰表型變化,利用熒光定量RT-PCR檢測轉基因植物的分子機制變化發(fā)現(xiàn),在經過12h的DEX誘導的GVG-OsSAPP3轉基因水稻,衰老相關因子NAP基因和葉綠素降解相關基因PAO、NYC的表達量上調,且隨著衰老的加劇表達量是上升的,光合作用相關基因PSaA、PSbA和葉綠素合成相關基因CAO表達量下調,且隨著衰老的加劇表達量是下降的。4.突變體鑒定、表型分析將所獲得OsSAPP2基因的突變體水稻種子進行基因型鑒定。結果發(fā)現(xiàn),OsSAPP2基因的突變體水稻單株均為T-DNA雜合插入。田間表型觀察發(fā)現(xiàn),在分蘗期開始,OsSAPP2基因的突變體水稻的分蘗少,在完熟期OsSAPP2基因的突變體水稻大部分葉片還是綠色未衰老的狀態(tài)。綜合以上本文研究結果,我們認為過表達OsSAPP2和OsSAPP3基因可以導致轉基因水稻葉片發(fā)生一系列的早衰表型,參與植物葉片衰老的調控,是正向調節(jié)因子。
【圖文】：

圖 1 OsSAPP2 蛋白的亞細胞定位A：左到右分別為熒光通道、明場、疊加圖；B：左到右分別為 35S-OsSAPP2-GFP 蛋白熒光通道、明場、疊加圖。（Bar=10μm）Fig1 Subcellular localization of OsSAPP2 proteinA: Left to right are GFP、Bright、Merged;B: Left to right are 35S-OsSAPP2-GFP protein GFP、Bright、Merged. (Bar=10μm)2.3.2 35S-OsSAPP2 轉基因植株純合篩選選取已經在前期實驗中經過目的基因表達水平檢測的 35S-OsSAPP2 轉基因水稻，確定其為超表達株系：line1、line8、line48、line58 的 T2代種子和 SN9816 種子各 50 粒經過催芽后播種于苗床中。在苗床上培養(yǎng)三周左右，分別隨機選取 30 棵 35S-OsSAPP2 轉基因水稻苗提取其總 DNA，進行 PCR 擴增檢測，以 SN9816 的 DNA 和水為陰性對照。部分結果顯示（圖 2）：line1、line8、line48、line58 所進行檢測的 30 株苗在 500bp時均有目的片段，確定其均為陽性植株。并經過兩年的的篩選與檢測，確定 line1、line8、line48、line58 四個株系為純合株系，選取 20 株苗每四株插于一個盆栽桶中，并對其進行后續(xù)的實驗指標的測定。

圖 1 OsSAPP2 蛋白的亞細胞定位A：左到右分別為熒光通道、明場、疊加圖；B：左到右分別為 35S-OsSAPP2-GFP 蛋白熒光通道、明場、疊加圖。（Bar=10μm）Fig1 Subcellular localization of OsSAPP2 proteinA: Left to right are GFP、Bright、Merged;B: Left to right are 35S-OsSAPP2-GFP protein GFP、Bright、Merged. (Bar=10μm)2.3.2 35S-OsSAPP2 轉基因植株純合篩選選取已經在前期實驗中經過目的基因表達水平檢測的 35S-OsSAPP2 轉基因水稻，確定其為超表達株系：line1、line8、line48、line58 的 T2代種子和 SN9816 種子各 50 粒經過催芽后播種于苗床中。在苗床上培養(yǎng)三周左右，分別隨機選取 30 棵 35S-OsSAPP2 轉基因水稻苗提取其總 DNA，進行 PCR 擴增檢測，以 SN9816 的 DNA 和水為陰性對照。部分結果顯示（圖 2）：line1、line8、line48、line58 所進行檢測的 30 株苗在 500bp時均有目的片段，確定其均為陽性植株。并經過兩年的的篩選與檢測，確定 line1、line8、line48、line58 四個株系為純合株系，選取 20 株苗每四株插于一個盆栽桶中，，并對其進行后續(xù)的實驗指標的測定。
【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S511

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;美培育出抗多種惡劣環(huán)境的轉基因水稻[J];寧波農業(yè)科技;2004年04期

2 向陽;;抗蟲轉基因水稻檢測技術研究綜述[J];安徽農學通報;2019年10期

3 袁曦;樊海利;李敦松;;抗蟲轉基因水稻對稻田天敵的影響研究進展[J];廣東農業(yè)科學;2017年10期

4 朱月季;朱萌;馬成林;;規(guī)范信念、感知風險與農戶轉基因水稻種植意愿[J];中國食物與營養(yǎng);2018年05期

5 溫李;鞠穎;仝澤方;謝以偉;李炳學;張寧;;轉基因水稻的研究現(xiàn)狀及展望[J];貴州農業(yè)科學;2017年06期

6 張熠婧;;轉基因水稻商業(yè)化發(fā)展的影響因素分析[J];中國農業(yè)文摘-農業(yè)工程;2016年05期

7 張慧;況慧云;程大軍;謝煒;;淺談轉基因水稻發(fā)展中存在的問題及對策[J];農業(yè)科技通訊;2015年06期

8 Su J;;新型轉基因水稻既高產又環(huán)保[J];生物技術進展;2015年05期

9 ;轉基因水稻不可商業(yè)化種植[J];農家致富;2017年09期

10 肖顯靜;;轉基因水稻風險評價中的無知和理性[J];綠葉;2013年12期

相關會議論文 前10條

1 李海青;劉煒;;抗稻瘟病轉基因水稻的培育[A];植物分子生物學與現(xiàn)代農業(yè)——全國植物生物學研討會論文摘要集[C];2010年

2 裴新梧;;轉基因水稻與環(huán)境安全性[A];新觀點新學說學術沙龍文集44：轉基因植物與食品安全[C];2010年

3 彭于發(fā);;轉基因水稻的安全性[A];科技創(chuàng)新與綠色植保——中國植物保護學會2006學術年會論文集[C];2006年

4 孫明法;姚立生;朱國永;王愛民;何沖霄;萬林生;;轉基因水稻安全性問題的探討和研究[A];江蘇省遺傳學會第七屆二次代表大會暨學術研討會論文摘要匯編[C];2008年

5 陸永良;;抗除草劑轉基因水稻安全評價[A];第九屆全國雜草科學大會論文摘要集[C];2009年

6 徐海濱;;轉基因水稻的研發(fā)和食用安全性評價概況[A];海峽兩岸第三屆毒理學研討會論文摘要[C];2005年

7 李錢峰;劉巧泉;姚泉洪;張達江;顧銘洪;;在轉基因水稻種子中表達重組的耐熱耐酸植酸酶[A];江蘇省遺傳學會第七屆代表大會暨學術研討會論文摘要匯編[C];2006年

8 李海青;柳絮;劉煒;;抗稻瘟病和條紋葉枯病轉基因水稻的培育[A];第六屆中國植物逆境生理學與分子生物學學術研討會論文摘要匯編[C];2010年

9 李聰;張啟軍;宗壽余;孫永華;賴東;劉少奎;呂川根;;雙價抗蟲轉基因水稻的抗蟲鑒定[A];江蘇省遺傳學會第八屆會員代表大會暨學術研討會論文集[C];2010年

10 Yichun Hu;Qin Zhuo;Zhaolong Gong;Jianhua Piao;Xiaoguang Yang;;抗蟲轉基因水稻三代生殖毒性研究[A];達能營養(yǎng)中心2019年論文匯編：轉基因食品與安全[C];2019年

相關重要報紙文章 前10條

1 本報記者 馬愛平;轉基因水稻“走出去”，歐盟為何不是第一站[N];科技日報;2018年

2 魯偉 劉濤;轉基因水稻再獲安全證書[N];中國食品安全報;2015年

3 記者 黃俊華 吳文娟 通訊員 杜巍;我省嚴查轉基因水稻種子非法銷售和種植[N];湖北日報;2014年

4 本報記者 張旭;安全證書即將到期 轉基因水稻放閘呼聲再起[N];21世紀經濟報道;2013年

5 吳銘;湖北嚴查轉基因水稻種子非法銷售和種植[N];中國食品安全報;2014年

6 本報記者 陳巖鵬;轉基因水稻商業(yè)化難題[N];華夏時報;2013年

7 李微敖 陳紅霞;專家:轉基因水稻產業(yè)化不能再等[N];糧油市場報;2013年

8 本報記者 王鴻良;轉基因水稻何時上餐桌？[N];北京日報;2012年

9 本報記者 王硯文;國家未批準生產或流通轉基因水稻[N];北京日報;2012年

10 本報記者何濤;轉基因水稻推廣再起波瀾[N];廣州日報;2010年

相關博士學位論文 前10條

1 凌飛;抗鱗翅目和鞘翅目害蟲轉基因水稻培育[D];華中農業(yè)大學;2017年

2 杜紅方;轉基因水稻作為肉仔雞日糧原料的安全性評價[D];中國農業(yè)科學院;2006年

3 陳良燕;抗蟲基因對受體水稻（Oryza sativa）的適合度效應研究[D];復旦大學;2005年

4 代玉華;RNAi介導的抗RSV轉基因水稻研究[D];中國農業(yè)科學院;2007年

5 方軍;蘇云金桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白vip3基因及其在轉基因水稻中的應用[D];浙江大學;2008年

6 毛碧增;轉基因水稻抗病性的遺傳和對發(fā)育調控的機理研究[D];浙江大學;2008年

7 徐曉麗;在轉基因水稻種子里表達細菌α-淀粉酶和真菌葡萄糖淀粉酶[D];浙江大學;2007年

8 于燕波;近紅外光譜分析技術在轉基因水稻識別和高油棉籽篩選中的應用研究[D];中國農業(yè)大學;2014年

9 沈鵬;水稻磷脂酶Dα1在耐鹽中的作用及其機理研究[D];南京農業(yè)大學;2009年

10 高建華;兩種Bt融合基因抗蟲性能及其轉基因水稻的研究[D];浙江大學;2011年

相關碩士學位論文 前10條

1 于梅梅;利用CRISPR/Cas9技術改良稻米外觀和食味品質的研究[D];揚州大學;2019年

2 楊宇;轉基因水稻G6H1和轉基因玉米C00303.5基體標準物質研制[D];上海交通大學;2018年

3 張藝函;水稻葉片衰老相關蛋白磷酸酶編碼基因OsSAPP2、OsSAPP3功能分析[D];沈陽農業(yè)大學;2019年

4 曹璇;磷高效轉基因水稻磷效率及根際土壤磷組分特征差異[D];天津農學院;2015年

5 鄭蘭;七種轉基因水稻質粒DNA標準物質研制[D];上海交通大學;2017年

6 王亞楠;轉基因水稻PA110-15品系特異性檢測方法的建立[D];揚州大學;2018年

7 黃樹清;抗稻飛虱耐草甘膦轉基因水稻培育[D];華中農業(yè)大學;2016年

8 張虎;qPCR檢測轉基因水稻拷貝數(shù)以及拷貝數(shù)與農藝性狀關系的研究[D];南京農業(yè)大學;2016年

9 崔勝男;水稻葉片衰老相關蛋白磷酸酶編碼基因OsSAPP3功能分析[D];沈陽農業(yè)大學;2018年

10 王超霞;轉基因水稻種子可培養(yǎng)內生微生物變異分析[D];浙江工商大學;2018年

本文編號：2701856