【摘要】：紅花(Carthamin tictorius L.)是一種具有活血通經(jīng),散瘀止痛之功效的傳統(tǒng)藥用植物,入藥部位為其干燥管狀花�，F(xiàn)代藥理研究表明,它具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗過敏等作用,其主要的藥效成分為黃酮醇類化合物(如山萘酚及其苷類,槲皮素及其苷類)以及特異性查爾酮化合物(如羥基紅花黃色素A、Carthamin等)。迄今為止,模式植物中黃酮的生物合成途徑已有很多的研究,普遍認(rèn)為,其源于苯丙氨酸途徑,通過查爾酮合成酶這一橋梁啟動黃酮類成分的生物合成。但是關(guān)于紅花中黃酮的生物合成途徑,尤其是特有的活性查爾酮成分生物合成途徑研究仍鮮有報道�；诒菊n題組前期構(gòu)建的紅花花冠轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫以及Y品系(黃色花,富含HSYA)和W品系(白色花,不含HSYA)時序性差異表達(dá)圖譜,我們篩選出在Y品系特異性高表達(dá)的266個差異基因,其中包含了參與紅花生物合成途徑的重要結(jié)構(gòu)基因:查爾酮合成酶基因CHS、查爾酮異構(gòu)酶基因CHI、黃酮苷末端修飾酶UGT和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MYB等多個基因。首先,借助RACE克隆技術(shù)拼接出差異基因(CtCHS1、Ct CHI1、UGT)和轉(zhuǎn)錄因子(CtMyb13)全長。氨基酸序列同源性比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示CtCHS1與其他家族的查爾酮合成酶具有87%的氨基酸相似度,CtCHI1與來自Saussurea medusa的CHI有高達(dá)92%的氨基酸相似度,后者的過表達(dá)可以顯著提高水母雪蓮毛狀根中的芹菜素含量。為了驗證基因的體外功能,我們運(yùn)用異源表達(dá)技術(shù),分離純化出基因編碼蛋白酶CtCHS1和CtCHI1,并對酶體外活性進(jìn)行底物篩選和催化參數(shù)檢測。體外實驗結(jié)果表明CtCHS1具有典型的CHS活性,即催化3個丙二酰輔酶A和1個香豆酰輔酶A生成柚皮素,CtCHI1可以催化2,,4,,4,6,-羥基查爾酮異構(gòu)化為柚皮素,從而證明CtCHS1和CtCHI1均是具有活性的催化蛋白酶。為了分析基因在植物體內(nèi)的定位特征,將構(gòu)建的重組瞬時表達(dá)載體pMT39-CtCHS1和pMT39-CtCHI1通過農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)侵染擬南芥原生質(zhì)體和煙草進(jìn)行瞬時表達(dá),亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示pMT39-CtCHS1定位在細(xì)胞質(zhì),pMT39-CtCHI1定位在細(xì)胞核。構(gòu)建35S啟動的真核重組載體并融合GFP標(biāo)簽,通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化紅花Y品系,實現(xiàn)紅花植株水平的基因工程操作和新基因在蛋白水平的檢測。和空載組比較,在mRNA水平上,過表達(dá)CtCHS1可以激活上游基因PAL2,PAL3,4CL2,CHS4和CHS6的表達(dá),同時抑制4CL1,4CL3,4CL5,CHI2和DFR1的表達(dá)。在代謝水平上,CtCHS1過表達(dá)可以促使醌式查爾酮化合物HSYA和Carthamin分別上調(diào)19.83%和29.48%,黃酮醇類化合物呈現(xiàn)出與之完全相反的趨勢,均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào),槲皮素,槲皮素-3-O-葡萄糖苷下調(diào)高達(dá)50~60%,山萘酚和蘆丁也分別下降14.41%和24.89%,山萘酚-3-O-β-D葡萄糖苷下調(diào)17.06%,D-Phenylalanine下調(diào)39.51%。由此推測,CtCHS1可能參與正向調(diào)節(jié)醌式查爾酮化合物分支的含量積累,并抑制黃酮醇類分支化合物的生成。利用葉盤轉(zhuǎn)化法我們獲得了CtCHI1過表達(dá)煙草植株,CtCHI1過表達(dá)促進(jìn)了上游基因NtC4H和Nt4CL表達(dá)。HPLC結(jié)果顯示花青素苷元下降高達(dá)64.55%,槲皮素苷元在下降高達(dá)70%,山萘酚苷元則顯著增加10%~20%。由此可以看出CtCHI1的過表達(dá)在煙草中對代謝產(chǎn)物的積累起了分流作用。在轉(zhuǎn)基因紅花中,CtCHI1過表達(dá)可以促進(jìn)上游基因CtPAL3,CtC4H1和CtCHS1分別增長3.88,2.12和3.03倍,抑制下游基因CtF3H和CtDFR2的表達(dá)。為了評價CtCHI1過表達(dá)對轉(zhuǎn)基因紅花代謝組的影響,我們對轉(zhuǎn)基因組和未轉(zhuǎn)基因組的紅花進(jìn)行了PCA和PLS-DA分析,通過PCA分析,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因組和未轉(zhuǎn)基因組代謝組主成分可以得到有效分離。另外,監(jiān)督PLS-DA在負(fù)離子模式下能得到很好的響應(yīng),可以分離出788差異性代謝產(chǎn)物。對次生代謝物進(jìn)行UPLC-QTOF/MS定量分析表明,CtCHI1過表達(dá)可以顯著提高HSYA和山萘酚-3-O-蕓香糖苷,二氫山萘酚和蘆丁的含量。在紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中,共有27個糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因全長,基于時序性表達(dá)圖譜分析,我們篩選出在兩個品系的生長發(fā)育過程中具有顯著差異的CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示CtUGT3和CtUGT16歸類到廣泛參與植物體內(nèi)代謝進(jìn)程的UGT71亞家族中。Ct UGT25與PoUGT具有很高的序列相似度,隸屬于UGT90亞家族,主要參與黃酮類化合物的糖基化修飾。將CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25與已經(jīng)報道的10個黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行多序列比對,結(jié)果顯示這三個UGT基因與黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因具有很高的同源性。由此可以預(yù)見,CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25可能也具有參與紅花體內(nèi)黃酮類化合物的糖基化修飾功能。運(yùn)用WOLF PSORT亞細(xì)胞定位預(yù)測,我們發(fā)現(xiàn)CtUGT3和CtUGT16可能主要位于細(xì)胞質(zhì),CtUGT25可能主要位于葉綠體。Signal P4.1 Server分析證實這三個蛋白均沒有信號肽。這些結(jié)果顯示CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25可能不具有蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能,主要在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中發(fā)揮蛋白酶催化功能。通過MeJA誘導(dǎo)實驗,我們構(gòu)建了“基因-化合物”在紅花兩個不同品系中時序性表達(dá)相關(guān)網(wǎng)絡(luò),結(jié)果表明CtUGT3和CtUGT25在Y品系紅花中主要誘導(dǎo)山萘酚-3-O-葡萄糖苷黃酮醇的積累,在W品系中促進(jìn)槲皮素-3-O-葡萄糖苷黃酮醇的生成,CtUGT16則廣泛參與兩個紅花品系中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的正向調(diào)控。另外,我們首次對紅花MYB家族進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析,從轉(zhuǎn)錄祖數(shù)據(jù)庫中共篩選出21個R2R3-MYB,利用multiple em for motif elicitation(MEME)和Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)分析R2R3-MYB中10個motif所在位置及功能,結(jié)果顯示motif 3和motif 6是保守DNA結(jié)合域,其他motif多為未知功能結(jié)構(gòu)域。通過基因芯片和化合物時序性表達(dá)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB13,MYB14與HSYA和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的積累呈正相關(guān)關(guān)系("#r"#≥0.7),且MYB13與MYB14序列高度相似,在進(jìn)化上具有近源關(guān)系。為了研究MYB調(diào)控的分子機(jī)制,我們構(gòu)建了紅花花冠次級酵母文庫,通過Y2H共轉(zhuǎn)法篩選出了與MYB13互作的7個蛋白:CtSDGL,CtEPGL,CtPHOX1L,CtB2L,CtASC1,CtMPL1,CtMPL2。更深入的研究正在進(jìn)行中。綜上所述,過表達(dá)CtCHS1和CtCHI1可以正反饋調(diào)控上游基因PAL,CHS的表達(dá),并促進(jìn)紅花中醌式查爾酮類化合物的積累;但抑制了下游基因表達(dá)。Ct UGT3,CtUGT16和CtUGT25廣泛參與紅花體內(nèi)黃酮醇類化合物的糖基化修飾。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB13可能正向調(diào)控HSYA和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的積累。本研究結(jié)果為闡明紅花黃酮類成分的生物合成途徑提供了重要科學(xué)依據(jù)。
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圖 1.1 兩種紅花品系(ZHH0119 和 XHH007)及其不同發(fā)育期縱切面和花瓣狀態(tài)a,b,c: 紅花 ZHH0119 品系特征圖;d, e, f: 紅花 XHH007 品系特征圖; a,d:花序;b,e:界定的兩個品系四個發(fā)育期縱切面;c, f：界定的兩個品系四個發(fā)育期花瓣形態(tài)igure 1.1 Two safflower line (ZHH0119 and XHH007) and their different floret developmental stage, c: ZHH0119 Yellow line. d, e, f: XHH007 White line. a, d: Inflorescence of safflower. b,ongitudinal section of inflorescence from the two lines of different stages. c, f: Differevelopmental stage of petals from two line corresponding to b and e.（二）標(biāo)準(zhǔn)化 cDNA 文庫構(gòu)建將不同發(fā)育期高質(zhì)量的 RNA 等量混勻，使用 CloneMiner cDNA Libraonstruction Kit (Invitrogen)試劑盒，并連接 pDONR 222 質(zhì)粒構(gòu)建初級 cDNA 文庫用限制性內(nèi)切酶 Hind III 和 BamH I 消化提取 DNA，經(jīng) DNA 結(jié)合柱系統(tǒng)純化初DNA 文庫，即可獲得標(biāo)準(zhǔn)化的 cDNA 文庫，，轉(zhuǎn)化進(jìn) Escherichia coli. 感受態(tài)菌H10B 測序。（三）ORF 序列分析使用軟件 TransDecoder 檢測 ORF，方法如下：在轉(zhuǎn)錄本中鑒定最長的 ORF 序列

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