【摘要】：甘草作為我國最常用的大宗藥材之一,始載于《神農本草經》,在中國有著兩千多年的藥用歷史,具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥等作用。2015版《中華人民共和國藥典》明確規(guī)定按干燥品計算,甘草樣品中甘草苷(C21H22O9)的含量不得低于0.50%。本課題組前期調查研究發(fā)現:大量栽培甘草中甘草苷的含量難以達到藥典規(guī)定的最低標準,嚴重影響栽培甘草的質量。因此,本課題首先采用X射線輻照處理甘草種子,以期通過基因突變快速獲得優(yōu)質高產的甘草栽培品。為進一步闡釋烏拉爾甘草黃酮代謝途徑的分子機制:一方面從甘草苷生物合成關鍵功能基因CHS和CHI的基因多態(tài)性進行分析;另一方面挖掘其轉錄組數據,解析影響甘草黃酮類化合物生物合成途徑的主要差異表達基因。本論文采用6個梯度X射線輻照處理烏拉爾甘草種子,栽培一年后,利用HPLC法對獲得的188株甘草樣品中4種主要黃酮類化合物(甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素)進行含量分析,篩選出5株黃酮含量及產量較高的輻照甘草樣品以及5株黃酮含量及產量較低的空白樣品作為功能基因分析的實驗材料。采用RT-PCR法對10株烏拉爾甘草樣品進行CHS和CHI的基因多態(tài)性分析,篩選出黃酮高/低含量組樣品的CHS和CHI主流單倍型;利用生物信息學軟件對主流CHS和CHI基因單倍型進行分析,以解析功能基因多態(tài)性對黃酮類化合物生物合成的影響。進一步篩選出2個黃酮類含量及產量較高的輻照甘草樣品和1個黃酮類含量及產量較低的空白甘草樣品進行轉錄組分析,獲得影響甘草黃酮類化合物生物合成的5條代謝途徑,并對其差異表達基因進行qRT-PCR基因相對表達量分析。本論文取得的研究結果如下:(1)X射線輻照處理對烏拉爾甘草黃酮類化合物積累水平的影響研究運用HPLC法對188株甘草樣品中的甘草苷、異甘草苷、甘草素和異甘草素進行含量測定,并計算其產量。結果發(fā)現:大部分輻照甘草樣品中甘草苷、異甘草苷的含量和產量均顯著高于空白對照,且隨著輻照劑量的提高,其含量和產量總體呈現先上升再下降再上升的趨勢。綜合比較,50Gy輻照劑量組的黃酮類成分產量最優(yōu)。以黃酮類化合物高含量和高產量為指標,篩選出5個X射線輻照處理甘草樣品:A6-1、B6-2、B6-4、C1-1、C3-4;以黃酮類化合物低含量、低產量為指標,在空白對照中挑選出5個樣品:AO-2、BO-1、B0-3、C0-2、C0-3,進行進一步的功能基因多態(tài)性分析。(2)X射線輻照處理對甘草查爾酮合酶基因多態(tài)性的影響研究采用RT-PCR法,以烏拉爾甘草輻照樣品B6-2、B6-4、C1-1和烏拉爾甘草空白樣品BO-1、B0-3、C0-2為實驗材料,共克隆得到115條CHS基因cDNA序列,全長均為1175bp,包含1個完整的開放閱讀框,編碼389個氨基酸殘基。確定了91種CHS單倍型,65種CHS氨基酸序列類型�？瞻讓φ战M中存在54種單倍型,其中單倍型24為主流單倍型,編碼氨基酸序列類型AA-13。輻照處理組中存在37種單倍型,其中單倍型61為主流單倍型,編碼氨基酸序列類型AA-47;單倍型54出現頻次也較高,其編碼氨基酸序列類型AA-48。氨基酸變異位點分析發(fā)現:193位點的V/I變異,229位點的I/V變異,383位點的I/V變異可能影響黃酮的積累水平。(3)X射線輻照處理對甘草查爾酮異構酶基因多態(tài)性的影響研究采用RT-PCR法,以烏拉爾甘草輻照樣品A6-1、B6-2、B6-4、C1-1、C3-4和烏拉爾甘草空白樣品A0-2、B0-1、B0-3、C0-3為實驗材料,共克隆得到173條CHI基因cDNA序列,全長均為690bp,包含1個完整的開放閱讀框,編碼229個氨基酸殘基。共確定了111種CHI單倍型,89種CHI氨基酸序列類型�？瞻讓φ战M中存在47種單倍型,其中單倍型68為主流單倍型,編碼氨基酸序列類型AA-57。輻照處理組中存在67種單倍型,其中單倍型3為主流單倍型,編碼氨基酸序列類型AA-3。CHI氨基酸序列的82位點D/E突變可能與黃酮含量積累水平有關。(4)甘草黃酮高/低含量組特異CHS氨基酸序列生物信息學分析對空白甘草樣品CHS主流氨基酸序列類型AA-13以及輻照處理甘草樣品CHS主流氨基酸序列類型AA-47及AA-48進行生物信息學分析,發(fā)現其物理化學性質相近。AA-13與AA-47的二級結構及三級結構較為接近,均與AA-48存在差異。三者均不含信號肽,位于膜外,無跨膜結構域,推測CHS不是分泌型蛋白而是留在細胞質中催化合成類黃酮等物質。此外,不同物種間CHS序列區(qū)分度良好。根據模建蛋白的結合位點預測,甘草黃酮高含量組主流氨基酸序列類型AA-47的383位纈氨酸是蛋白結合位點,能夠與香豆酰輔酶A結合。甘草黃酮高含量組的主流氨基酸序列類型AA-48的229位纈氨酸是蛋白結合位點,能夠與丙二酰輔酶A結合。而甘草黃酮低含量組主流氨基酸序列類型AA-13的229位和383位的異亮氨酸均不是蛋白結合位點。(5)甘草黃酮高/低含量組特異CHI氨基酸序列生物信息學分析對空白甘草樣品CHI主流氨基酸序列類型AA-57以及輻照處理甘草樣品CHI主流氨基酸序列類型AA-3進行生物信息學分析,發(fā)現兩者物理化學性質相近,二級結構和三級結構均相似。兩者均不含信號肽,位于膜外且無跨膜區(qū),推測CHI不是分泌型蛋白而是留在細胞質中催化合成類黃酮等物質。此外,不同物種間CHI序列區(qū)分度良好。AA-3在82位點為天冬氨酸(D),AA-57在82位點為谷氨酸(E)。82位點D/E變異僅出現在空白對照組氨基酸序列中。但通過模建蛋白結合位點預測,發(fā)現AA-3與AA-57的82位點氨基酸殘基均不是底物結合位點。(6)黃酮類化合物差異積累的烏拉爾甘草樣品轉錄組分析高含量高產量輻照組烏拉爾甘草樣品C3-4、B6-4和低含量低產量空白組烏拉爾甘草樣品B0-1分別重新命名為H1、H2和L1。獲得這3個烏拉爾甘草樣本的轉錄組數據,其正確率高,基因組覆蓋率良好。獲得了3795個以上新轉錄本,豐富了甘草的基因庫�；虮磉_水平分析發(fā)現:3個樣本間的差異較大,H1與L1、H2與L1兩兩比較,分別獲得了4527和4230個差異基因,2個比較組共有1875個核心差異基因。H1和H2樣品的核心差異基因表達模式基本一致,而L1樣品表達上調的基因多于H1和H2。因此推測輻照處理可能影響甘草基因表達水平,從而影響甘草黃酮類化合物的積累。共確定5條代謝途徑上的核心差異基因與黃酮類化合物生物合成密切相關,包括:黃酮類化合物代謝途徑、萜類代謝途徑、植物激素信號轉導途徑、植物晝夜節(jié)律調控通路、淀粉和蔗糖代謝途徑。5條代謝途徑上的核心差異基因如下:在甘草黃酮類代謝途徑上,共獲得23個核心差異基因。其中H1和H2共同下調基因10個,包括:1個苯丙氨酸解氨酶基因,1個β-葡萄糖苷酶基因,1個咖啡酸3-0-甲基轉移酶基因,2個松柏醛脫氫酶基因和5個過氧化物酶基因。苯丙氨酸解氨酶是苯丙素生物合成途徑的關鍵酶,輻照樣品H1和H2中編碼該酶的基因表達量下調則表明輻照處理可能抑制了該酶的表達,從而影響黃酮類化合物的積累。此外,相對于L1而言,H1中的2個查爾酮合酶基因表達顯著上調,該基因為甘草黃酮合成途徑上的關鍵酶基因,極大影響黃酮類化合物的生物合成。下游旁路途徑的β-葡萄糖苷酶、松柏醛脫氫酶和過氧化物酶的基因表達均下調,表明苯丙素類代謝途徑上的反應底物大多流向黃酮合成途徑,從而導致輻照樣品中黃酮類化合物大量積累。在萜類代謝途徑上,共獲得9個核心差異基因。其中H1和H2共同上調基因有5個,分別為1個9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因,該基因編碼脫落酸,與黃酮類化合物積累相關;1個赤霉素2-氧化酶基因和2個赤霉素3-β-雙加氧酶基因具有調節(jié)植物光合作用,影響植物初生代謝功能,從而為黃酮等次生代謝產物積累提供底物;1個1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因上調,促進單萜、二萜和類胡蘿卜素生物合成。H1和H2共同下調基因僅1個,即辣椒紅素合成酶基因,該基因下調有利于脫落酸的合成,促進黃酮類化合物的積累。在植物激素信號轉導通路上,共獲得18個核心差異基因。其中H1和H2共同上調基因有3個,分別為蛋白運輸抑制基因、赤霉素受體GID1基因和茉莉酸甲酯-結構域蛋白5基因。前二者基因表達上調,促進蛋白泛素化和二萜生物合成。茉莉酸甲酯-結構域蛋白5基因則誘導植物莖成熟和抗脅迫作用,表明輻照處理可能加快了植物成熟并促進植物抗逆能力。其中H1和H2共同下調基因有10個,分別為4個SAUR生長素超家族反應蛋白基因,1個生長素反應性GH3家族蛋白基因,3個吲哚乙酸誘導蛋白10基因,1個含有組氨酸的磷酸轉移因子5基因和1個響應調節(jié)器4基因。前三者下調,表明生長素合成代謝下調。后兩者下調,表明細胞分裂素合成代謝下調。生長素、細胞分裂素合成代謝下調,則植物生長緩慢,可能反映了輻照植物早熟狀態(tài)。此外,基于生長-分化平衡假說、最佳防御假說和資源獲得假說,生長緩慢則初級代謝下調而次級代謝上調,從而促進黃酮類化合物的生物合成。在植物晝夜節(jié)律途徑上,共獲得7個核心差異基因,在輻照樣品H1和H2中表達均上調,分別為1個查爾酮合酶基因,3個偽響應調節(jié)器5基因,2個開花蛋白FT基因和1個生物鐘基因。前兩者分別與甘草抗X射線輻照作用和反饋調節(jié)作用相關。后兩者與植物花期調控相關,進一步反映了輻照處理可能使花期提前,而花期中花色素等黃酮下游產物會影響黃酮類化合物生物合成。在淀粉蔗糖代謝途徑上,共獲得4個核心差異基因。在H1和H2中共同上調的基因有2個,分別是1,4-α-葡聚糖分支酶基因和β-淀粉酶基因,促進糊精、麥芽糖生成。在H1和H2中共同下調的基因有2個,分別是α-淀粉酶基因和蔗糖合酶基因。前者下調,則有利于淀粉向糊精、麥芽糖轉化,后者下調,則蔗糖合成下調。綜上,輻照甘草中多糖向單糖轉化上調,為次生代謝產物形成糖苷提供基礎。(7)烏拉爾甘草轉錄組核心差異基因相對表達量分析利用實時熒光定量PCR對12個核心差異基因的表達量進行驗證。苯丙氨酸解氨酶基因PAL(Glyur000106s00011717)、查爾酮合酶基因 CHS1(Glyur000424s00026890)、CHS2(Glyur006062s00044203)、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因NCED(Glyur000278s00017280)、赤霉素2-氧化酶基因GA20x(Glyur000261s00014360)、赤霉素受體基因GID1(Glyur000158s00011331)、生長素超家族反應蛋白基因SAUR(Glyur000017s00002448)、β-淀粉酶基因AMYB(Glyur000047s00004005)、咖啡酸3-0-甲基轉移酶基因COMT(Glyur000116s00009246)、茉莉酸甲酯-結構域蛋白5基因JAZ(Glyur002299s00036262)、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因DXS(Glyur000231s00022061)和生物鐘基因LHY(Glyur000116s00009244)。除DXS和COMT基因外,其他基因表達量的驗證結果與轉錄組表達量分析結果一致。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.71
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本文編號：2628623