【摘要】：實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,小麥(Triticum aestivum L.)胚乳發(fā)育需經(jīng)歷細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)過程,淹水可加速其進(jìn)程。為進(jìn)一步揭示淹水脅迫下小麥胚乳細(xì)胞PCD進(jìn)程提前的生理和細(xì)胞學(xué)機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)以華麥8號(hào)為材料,在開花當(dāng)天對(duì)其進(jìn)行淹水處理,從顯微和超微結(jié)構(gòu)水平研究了胚乳細(xì)胞中線粒體動(dòng)態(tài)變化;采用免疫熒光、蛋白印跡等技術(shù)多角度研究了胚乳中細(xì)胞色素c釋放情況;利用實(shí)時(shí)定量PCR研究了胚乳中線粒體滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)組分相關(guān)基因的表達(dá)情況。另外,研究了抗環(huán)血酸、環(huán)孢菌素A和過氧化氫處理對(duì)耐濕品種華麥8號(hào)和不耐濕品種華麥9號(hào)生理生化和PCD進(jìn)程的影響。研究結(jié)果表明:1.未淹水情況下,胚乳細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示,發(fā)育早期胚乳中線粒體結(jié)構(gòu)完整,內(nèi)嵴清晰,花后12 d線粒體輕微變形,內(nèi)嵴模糊,花后20 d大部分線粒體降解,僅在細(xì)胞邊緣處存在少量線粒體,結(jié)構(gòu)模糊。線粒體膜電位和膜吸光度檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著胚乳細(xì)胞發(fā)育時(shí)間的延長線粒體膜電位膜降低,膜通透性增大,線粒體損傷加劇。淹水處理后,花后10 d胚乳細(xì)胞中部分線粒體明顯膨大,花后15 d胚乳細(xì)胞中大部分線粒體內(nèi)部出現(xiàn)電子透明區(qū)域,有被膜結(jié)構(gòu)包裹的未降解完全的線粒體存在;線粒體膜電位和膜吸光度低于同時(shí)期未淹水處理組。正常生長的小麥胚乳細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)隨著胚乳PCD的進(jìn)行逐漸被破壞,淹水脅迫導(dǎo)致這種損傷加劇,時(shí)間提前。2.未淹水情況下,免疫熒光結(jié)果顯示,在花后10 d之前胚乳細(xì)胞中細(xì)胞色素c主要定位于線粒體上,花后12 d細(xì)胞色素c開始從線粒體釋放到胞質(zhì)中,花后15 d和花后20 d細(xì)胞色素c進(jìn)一步釋放;超微細(xì)胞化學(xué)定位發(fā)現(xiàn),花后8 d細(xì)胞色素c主要集中在線粒體上,花后15 d在線粒體內(nèi)外均可檢測(cè)到細(xì)胞色素c的存在;蛋白印跡結(jié)果同樣顯示,花后12 d以后隨著胚乳細(xì)胞發(fā)育胞質(zhì)中細(xì)胞色素c含量逐漸增多。淹水脅迫下,免疫熒光和蛋白印跡結(jié)果都顯示,在花后10 d即可觀察到細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞質(zhì)中,并且釋放的細(xì)胞色素c含量高于同時(shí)期未淹水處理組。正常生長的小麥胚乳細(xì)胞中細(xì)胞色素c在花后12 d開始從線粒體釋放到胞質(zhì)中,而淹水脅迫下細(xì)胞色素c在花后10 d即開始從線粒體釋放,且釋放量大于同時(shí)期未淹水處理組。淹水脅迫導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放時(shí)間提前,釋放量增加。3.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,未淹水情況下,小麥胚乳細(xì)胞中VDAC2表達(dá)量基本不變、VDAC3表達(dá)量先增加后降低、ANT1表達(dá)量逐漸降低,與蛋白折疊相關(guān)基因HSP70和HSP90表達(dá)量均先降低后增加。而淹水處理后VDAC2和VDAC3表達(dá)量均在花后8 d顯著增加,ANT1表達(dá)量在花后10 d達(dá)到峰,HSP70和HSP90基因表達(dá)量均低于未淹水對(duì)照組。MPTP可能參與淹水脅迫促進(jìn)胚乳細(xì)胞PCD過程的調(diào)節(jié),而蛋白折疊障礙可能在其中承擔(dān)一部分作用。4.使用外源H_2O_2處理后,與未進(jìn)行藥物處理對(duì)照組相比,華麥8號(hào)胚乳細(xì)胞中H_2O_2和O~(2-)含量上升,SOD和CAT活性增加,線粒體膜透性增加,細(xì)胞色素c釋放增多,caspase-like蛋白酶活性上升;華麥9號(hào)中變化趨勢(shì)類似,但與華麥8號(hào)相比較,細(xì)胞中O~(2-)積累更多、CAT活性上升幅度較小。使用外源抗環(huán)血酸處理后,華麥8號(hào)和華麥9號(hào)中H_2O_2含量均降低。使用外源環(huán)孢菌素A處理后,部分抑制了H_2O_2處理導(dǎo)致的ROS含量上升、線粒體膜透性增加、細(xì)胞色素c釋放增多和caspase-like蛋白酶活性上升等現(xiàn)象。以上結(jié)果說明,外源H_2O_2處理加劇了小麥胚乳細(xì)胞PCD,且華麥9號(hào)在遭遇外界脅迫后胚乳中ROS積累更多,抗氧化酶系統(tǒng)較弱,可能是其不耐濕的機(jī)制之一。綜上所述,淹水處理加劇小麥胚乳細(xì)胞中線粒體損傷和細(xì)胞色素c釋放,可能是淹水導(dǎo)致胚乳細(xì)胞PCD加劇和進(jìn)程提前的原因之一。線粒體在正常生長和淹水脅迫下小麥胚乳細(xì)胞PCD的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。華麥9號(hào)胚乳中ROS累積多以及抗氧化系統(tǒng)弱,可能是其不耐濕的原因之一。
【圖文】：

圖 1 細(xì)胞程序性死亡主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Gupta et al 2006）Fig.1 The major signal transduction pathways for programmed cell death（Gupta et al 2006）1.4.1 死亡受體途徑細(xì)胞表面的死亡受體（Death receptor）家族包括 8 種，它們共同的特點(diǎn)是具相似的、富含半胱氨酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)死亡區(qū)域（Death domain）（Ashkenaand Dixit 1998）。外界信號(hào)因子通過與相關(guān)配體結(jié)合使其發(fā)生寡聚化及結(jié)構(gòu)的改變暴露出能與銜接蛋白結(jié)合的胞內(nèi)死亡區(qū)域，聚集并激活銜接蛋白（caspase8 等）引發(fā)下游 caspases 的活化并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生（Ashkanazi and Dixi 1998）另外，激活的 caspase8 可以催化 Bid 的切割（Bcl-2 家族的促凋亡分子），作用于粒體外膜，在其他相關(guān)的 Bcl-2 家族成員的參與下誘導(dǎo)線粒體外膜通透性增加，，而促進(jìn)細(xì)胞色素 c 的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡（Kantari and Walczak 2011）。

3.1 淹水脅迫對(duì)小麥胚乳細(xì)胞 PCD 進(jìn)程的影響不同發(fā)育時(shí)期的未淹水處理和淹水處理的小麥胚乳 Evans Blue 染色結(jié)果（圖 2），隨著胚乳細(xì)胞的發(fā)育，染色反應(yīng)加深。8 DAF，在未淹水處理（對(duì)照淹水處理的小麥胚乳中都未觀察到被染色的死亡胚乳細(xì)胞，且對(duì)照較淹水處理麥籽粒更飽滿（圖 2A1, B1）。10 DAF，在未淹水處理和淹水處理的小麥胚乳未觀察到明顯染色反應(yīng)（圖 2 A2, B2）。12 DAF，未淹水處理的小麥胚乳中才出現(xiàn)少量染成藍(lán)色的死亡細(xì)胞（圖 2A3），而淹水處理組中有較多染成深藍(lán)色亡細(xì)胞（圖 2 B3）。15 DAF，未淹水處理的胚乳中可觀察到明顯的藍(lán)色，有更乳細(xì)胞死亡（圖 2A4），而淹水處理組中染色加深，染色細(xì)胞數(shù)量增加（圖 2 上述結(jié)果說明，未淹水處理的小麥胚乳經(jīng)歷了一個(gè) PCD 過程，淹水脅迫導(dǎo)致胚胞程序性死亡進(jìn)程提早，死亡數(shù)量較對(duì)照增加。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S512.1

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本文編號(hào)：2614623