【摘要】：鐵皮石斛為石斛屬植物,以莖入藥。由于目前鐵皮石斛相互引種,種源混亂,嚴(yán)重影響其品質(zhì)穩(wěn)定性,加上其喜溫暖濕潤氣候,不耐寒,有必要對其進行種質(zhì)資源評價及良種輔助篩選。本文收集了福建廈門、泰寧、邵武和云南、浙江等地區(qū)共33份鐵皮石斛栽培種和13份野生種,利用CDDP、SCoT、TRAP、CoRAP分子標(biāo)記技術(shù)對鐵皮石斛進行遺傳多樣性分析,并利用抗寒相關(guān)基因輔助篩選抗寒鐵皮石斛,結(jié)果如下:1、利用分子標(biāo)記技術(shù)分析鐵皮石斛遺傳多樣性16條CDDP引物,共擴增出151條帶,多態(tài)性條帶占總條帶95.3%,PIC平均0.815,RP平均1.653;14條SCoT引物共擴增出92條帶,多態(tài)性條帶占比93.9%;21對TRAP引物共擴增出278條帶,多態(tài)性條帶占比99.03%,PIC平均0.899,RP平均2.054;16對CoRAP引物共擴增出208條帶,多態(tài)性條帶占比93.2%,PIC平均0.880,RP平均1.806,四種分子標(biāo)記擴增結(jié)果表明試供鐵皮石斛遺傳背景豐富,有較高的遺傳多樣性。另外,針對鐵皮石斛抗寒基因開發(fā)的TRAP、CoRAP標(biāo)記分析中,野生種遺傳多樣性高于栽培種,表明在復(fù)雜多變的自然環(huán)境下,野生種抗性相關(guān)基因存在更大遺傳變異。遺傳參數(shù)上,CDDP標(biāo)記居群PPL平均為74.61%,居群H平均0.1992,居群I平均0.3128,居群間Gst為0.1778,居群間Nm為2.3118,;SCoT標(biāo)記中,PPL平均78.36%,H平均0.2310,I平均0.3552,Gst 0.265,Nm 1.387;TRAP標(biāo)記中,PPL平均82.85%,H平均0.2716,I平均0.4105,Gst 0.2017,Nm 1.9793;CoRAP標(biāo)記中,PPL平均79.80%,H平均0.2045,I平均0.3259,Gst 0.1808,Nm 2.2656。四種標(biāo)記遺傳參數(shù)表明鐵皮石斛遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi),居群間有一定的基因交流。聚類分析中,CDDP標(biāo)記在0.668時將鐵皮石斛分為2大類,但不同地區(qū)栽培種界限不明顯,相互重疊。野生種在相似性系數(shù)0.732時與栽培種分離,SCoT、TRAP、CoRAP標(biāo)記分別在0.59、0.536、0.61時將鐵皮石斛栽培種和野生種分離,不同地區(qū)的栽培種無法分離,主坐標(biāo)分析中顯示地理因素與不同地區(qū)鐵皮石斛沒有明顯的相關(guān)性,對于野生種和栽培種,四種分子標(biāo)記均能將其明顯分離,其中TRAPSCoTCoRAPCDDP。2、利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助篩選抗寒鐵皮石斛在CDDP標(biāo)記中,利用錨定WRKY、MYB、ERF抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子引物共同篩選出9份具有抗逆性的鐵皮石斛優(yōu)良種質(zhì);在SCoT標(biāo)記中,利用在抗寒鐵皮石斛中產(chǎn)生差異條帶的SCoT-8、SCoT-59、11(li)引物篩選出5份具有抗寒性的鐵皮石斛優(yōu)良種質(zhì);在TRAP標(biāo)記中,利用錨定CBF1、DREB1、CDPK1冷響應(yīng)相關(guān)基因引物篩選出11份具有抗寒性的鐵皮石斛優(yōu)良種質(zhì);在CoRAP標(biāo)記中,利用錨定冷響應(yīng)基因COR15a、KIN1、GsLRPK引物篩選出13份具有抗寒性的鐵皮石斛優(yōu)良種質(zhì);在STS標(biāo)記中,利用錨定DREB1、GsLRPK、KIN1基因的特異引物篩選出9份具有抗寒性的鐵皮石斛優(yōu)良種質(zhì);最后將CDDP、SCoT、TRAP、CoRAP、STS標(biāo)記篩選的抗寒鐵皮石斛綜合篩選,最終篩出3份抗寒鐵皮石斛種質(zhì),編號10、44、13。3、鐵皮石斛低溫脅迫中相關(guān)基因和生理變化研究及品質(zhì)測定低溫脅迫篩選的抗寒鐵皮石斛,其熱激蛋白HSP70、蛋白激酶LRPK、冷誘導(dǎo)KIN1、多糖合成DoPMM、轉(zhuǎn)錄因子DREB1基因大量表達,其中HSP70基因和冷誘導(dǎo)KIN1基因在脅迫處理期內(nèi),表達量持續(xù)上升,處理期間未見減少;DREB1轉(zhuǎn)錄因子和LRPK蛋白激酶基因在處理期間先顯著增加后逐漸降低,但仍高于對照表達量;多糖合成關(guān)鍵基因DoPMM在低溫處理期內(nèi)同樣先增加后降低,至解除脅迫時仍高于對照表達量。低溫處理下,耐寒鐵皮石斛可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸、SOD酶活在處理期間均呈現(xiàn)顯著增加并持續(xù)積累;丙二醛含量呈現(xiàn)波動現(xiàn)象,至處理結(jié)束時整體變化不顯著;電導(dǎo)率隨著時間的延長均出現(xiàn)顯著增大趨勢;不耐寒種在低溫脅迫下可溶性蛋白、可溶性糖顯著增加但含量低于耐寒種,且在處理后期出現(xiàn)游離脯氨酸、SOD酶活下降趨勢,丙二醛含量及電導(dǎo)率顯著增加趨勢;葉綠素含量則所有種質(zhì)均出現(xiàn)顯著下降趨勢,不耐寒種下降速率大于耐寒種。品質(zhì)測定中,10、44、13號鐵皮石斛多糖含量分別為32.80%,38.60%,28.30%,大于中國藥典規(guī)定最低含量;石斛堿含量分別為0.0307%,0.0315%,0.0360%;柚皮素含量分別為0.156 mg/g,0.187 mg/g,0.133 mg/g,品質(zhì)與抗寒能力綜合隸屬函數(shù)分析134410。
【圖文】：

圖 2.1 鐵皮石斛 CDDP 標(biāo)記正交設(shè)計擴增結(jié)果Fig.2.1 D. candidum CDDP marker orthogonal design amplification results綜合梯度退火實驗及單因素優(yōu)化實驗（部分實驗見圖 2.2、2.3），最終確定20 μL 體系，其中，DNA 模板 30 ng、引物 0.5 μmol/L、聚合酶 1.5 U、dNTPs0.2 mmol/L、Mg2+ 2.75 mmol/L，并進行體系驗證（圖 2.4）。應(yīng)用優(yōu)化體系，，以樣品 DNA 為模板，對 Collard 和 Mackill 發(fā)表的 21 條引物進行篩選，選擇多態(tài)性好，條帶清晰可辨的引物 16 條（表 2.6），利用 16 條引物對 46 份樣本進行擴增。

圖 2.1 鐵皮石斛 CDDP 標(biāo)記正交設(shè)計擴增結(jié)果Fig.2.1 D. candidum CDDP marker orthogonal design amplification resul綜合梯度退火實驗及單因素優(yōu)化實驗（部分實驗見圖 2.2、2.3），最20 μL 體系，其中，DNA 模板 30 ng、引物 0.5 μmol/L、聚合酶 1.5 U、0.2 mmol/L、Mg2+ 2.75 mmol/L，并進行體系驗證（圖 2.4）。應(yīng)用優(yōu)化以樣品 DNA 為模板，對 Collard 和 Mackill 發(fā)表的 21 條引物進行篩選，態(tài)性好，條帶清晰可辨的引物 16 條（表 2.6），利用 16 條引物對 46 份行擴增。
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239

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