實驗采用室內小型堆肥反應器以牛糞與稻草為堆肥物料進行為期一個月的高溫好氧堆肥。對堆體上、中、下層的溫度及環(huán)境溫度進行測定;對堆肥物料中纖維素、木質素和半纖維素的相對含量進行測定;利用高效液相色譜法(High pressure liquid chromatography,HPLC)測定葡萄糖含量和纖維二糖的含量;測定羧甲基纖維素酶(CMC酶)活性和β-葡萄糖苷水解酶(β-glucosidase)活性;通過構建β-glucosidase GH1、GH3家族基因克隆文庫的手段分析堆體中具有β-glucosidase GH1、GH3家族基因功能性微生物的群落組成和優(yōu)勢微生物種屬;利用實時熒光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR,q-PCR)判定β-glucosidase GH1、GH3家族中優(yōu)勢微生物種屬在堆肥各個時期的基因拷貝數(shù)的變化。通過分析堆肥進程中含β-glucosidase基因功能性微生物群落的演替、優(yōu)勢微生物種屬基因拷貝數(shù)的變化規(guī)律與β-glucosidase活性變化規(guī)律的相關性,進一步揭示含β-glucosidase基因功能性微生物的種類與拷貝數(shù)的變化規(guī)律與纖維素類物質降解的潛在關系。研究結果如下:在堆肥進程中,堆體的平均溫度在前3 d,快速升溫達到45℃即進入高溫期,并維持8 d后進入降溫期最后與環(huán)境溫度變化趨于一致。纖維素的相對含量在高溫期階段變化明顯,半纖維素的相對含量變化趨勢與其相似,木質素的相對含量總體上變化不大,且在降溫腐熟期有小幅的增加。葡萄糖含量在0-1 d呈現(xiàn)下降趨勢,在堆肥的第4 d葡萄糖含量出現(xiàn)第一個峰值(1.85 mmol/kg),第4-7 d呈現(xiàn)下降趨勢。第23 d葡萄糖的含量達到第二個峰值(5.35mmol/kg)。在第0-4 d,纖維二糖的含量的變化趨勢是先升高后降低,在高溫階段的后期和降溫腐熟的前期,纖維二糖含量一直處于較低水平,維持在0 mmol/kg-0.91 mmol/kg范圍內,與同一時期β-葡萄糖苷水解酶的較高活性相對應。從堆肥的第13 d起,纖維二糖大量累積,在第29 d的達到最大值(1.29 mmol/kg)。β-glucosidase活性在第4 d達到整個堆肥過程中的最大值(1.482μmol p-Nitr/g dw min)并在降溫腐熟期維持在0.429μmol p-Nitr/g dw min-0.533μmol p-Nitr/g dw min范圍內;CMC酶活性變化趨勢與β-glucosidase活性相似并在第7 d達到最大值(47.67μg glucose/g dw min)。在對克隆序列進行比對分析的過程中發(fā)現(xiàn),GH1細菌家族中,k-卡拉膠降解菌屬(Devosia sp.)主要在升溫期、高溫前期和降溫腐熟期出現(xiàn);大豆根瘤菌屬(Bradyrhi zobium)和微桿菌屬(Microbacterium)在各個時期均有出現(xiàn);根瘤菌屬(Rhizobium)在各個時期均有出現(xiàn),且主要存在于高溫前期和高溫后期;棲熱孢菌屬(Thermotoga)等在高溫前期出現(xiàn)的次數(shù)較多。GH3細菌家族中,寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)在各個時期均有出現(xiàn),多數(shù)存在于升溫期中;新月形單胞菌屬(Pelosinus)在升溫期和高溫前期出現(xiàn)的次數(shù)較多;分支桿菌屬(Mycobacterium)在高溫前期、高溫后期和降溫腐熟期中均有出現(xiàn)。GH3真菌家族中,木霉屬(Hypocrea)在升溫期、高溫前期和降溫腐熟期中均有出現(xiàn),在降溫腐熟期出現(xiàn)的次數(shù)較多;曲霉屬(Aspergillus)各個時期均有出現(xiàn),在升溫期中出現(xiàn)的次數(shù)較多;青霉屬(Penicillium)主要存在于升溫期和降溫腐熟期。在對q-PCR獲得的β-glucosidase GH1家族通用引物的基因拷貝數(shù)的分析中可以發(fā)現(xiàn),升溫期和降溫腐熟期的基因拷貝數(shù)較高溫期多。分析8對β-glucosidase GH1家族特異性引物可以發(fā)現(xiàn),GH1-5-2、GH1-3-9、GH1-3-5這三對引物在q-PCR獲得的高溫期的基因拷貝數(shù)明顯高于升溫期和降溫腐熟期,說明Rhizobium和Thermotoga的基因拷貝數(shù)在高溫期與β-glucosidase的產生和纖維素的降解存在正相關性,即在Rhizobium和Thermotoga對β-glucosidase的產生和纖維素的降解起著主要作用。q-PCR獲得GH3細菌家族的4對特異性引物的基因拷貝數(shù)在升溫期都較高,在高溫期基因拷貝數(shù)較低。證明Stenotrophomonas、Pelosinus和M ycobact erium均在升溫期產生β-glucosidase對纖維素的降解起到一定作用,而在高溫期的作用較弱。GH3B-3這對引物在降溫腐熟期的基因拷貝數(shù)明顯高于其他三個時期,可以說明Mycobacterium在降溫腐熟期產生β-glucosidase和纖維素的降解過程中起到主要作用。q-PCR獲得的β-glucosidase GH3真菌家族通用引物的基因拷貝數(shù)在各個時期都處于較高水平,這與真菌是纖維素降解的主要微生物群體有關。同時,分析3對特異性引物獲得的基因拷貝數(shù)可以發(fā)現(xiàn),3對引物在q-PCR獲得的基因拷貝數(shù)在各個時期的趨勢相同,并可以看出Hypocrea、Aspergillus和Penicillium在升溫期和降溫腐熟期對β-glucosidase的產生和纖維素的降解起到主要作用,在高溫期的作用較弱。
【學位單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S141.4;Q93
【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 農業(yè)廢棄物概述
        1.1.1 我國農業(yè)廢棄物的現(xiàn)況
        1.1.2 目前國內外農業(yè)廢棄物的處理技術
        1.1.3 我國農業(yè)廢棄物資源利用的實際意義
    1.2 堆肥概述
        1.2.1 堆肥的定義及發(fā)展歷史
        1.2.2 影響好氧堆肥化的主要因素
    1.3 堆肥中纖維素的降解
        1.3.1 纖維素概述
        1.3.2 降解纖維素的微生物
        1.3.3 纖維素的降解酶類
        1.3.4 β-glucosidase概述
    1.4 堆肥微生物學的研究
        1.4.1 堆肥微生物降解的基本原理
        1.4.2 堆肥過程中微生物的群落及動態(tài)
        1.4.3 堆肥微生物學的研究方法
    1.5 本實驗研究思路的提出
    1.6 研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 堆肥材料
        2.1.2 樣品采集
        2.1.3 儀器設備與試劑
        2.1.4 實驗試劑
    2.2 試驗方法
        2.2.1 溫度測定
        2.2.2 酶活測定
        2.2.3 纖維素含量的測定
        2.2.4 葡萄糖和纖維二糖含量測定
        2.2.5 堆肥中總DNA的提取及純化
        2.2.6 目的基因的擴增
        2.2.7 β-glucos idase基因克隆文庫的構建
        2.2.8 β-glucos idase基因q-P CR
3 結果與分析
    3.1 堆肥過程中理化性質的變化
        3.1.1 堆肥過程中物理性質的變化
        3.1.2 堆肥過程中化學性質的變化
    3.2 堆肥中 β- glucos idase基因克隆文庫的構建與分析
        3.2.1 β-glucos idase GH1家族基因克隆文庫的構建與分析
        3.2.2 β-glucos idas e GH3細菌家族基因克隆文庫的構建與分析
        3.2.3 β-glucos idas e GH3真菌家族基因克隆文庫的構建與分析
    3.3 堆肥中 β- 葡萄糖苷水解酶基因實時熒光定量PCR與分析
        3.3.1 β-glucos idas e GH1家族基因實時熒光定量PCR與分析
        3.3.2 β-glucos idas e GH3細菌家族基因實時熒光定量P CR與分析
        3.3.3 β-glucos idas e GH3真菌家族基因實時熒光定量P CR與分析
4 討論
5 結論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文

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本文編號：2836189