【摘要】：銹赤扁谷盜Cryptodestes ferrugineus(Stephens)是世界上發(fā)生最為普遍的儲糧害蟲,銹赤扁谷盜的成蟲和幼蟲主要以糧食的胚部為食,由于其繁殖能力強(qiáng),容易在糧庫里大量繁殖,對儲糧安全產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。由于磷化氫的長期使用,加上施藥者在使用過程中的不規(guī)范操作,致使銹赤扁谷盜普遍產(chǎn)生了高抗性。普遍的抗藥性和銹赤扁谷盜種群猖獗,已成為當(dāng)前糧食儲藏中最為嚴(yán)峻的問題。因此,研發(fā)新型的、對環(huán)境友好型的殺蟲劑,已成當(dāng)務(wù)之急。幾丁質(zhì)主要存在于真菌的胞壁、甲殼類動物的外殼和昆蟲的體壁中,高等哺乳動物不含有幾丁質(zhì),因此根據(jù)幾丁質(zhì)生物合成途徑研發(fā)新型殺蟲劑已經(jīng)成為當(dāng)今熱點。本研究以銹赤扁谷盜為研究對象,利用RNAi技術(shù)和實時熒光定量PCR(qPCR)對幾丁質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶-幾丁質(zhì)合成酶2(CHS2)基因的特性和功能進(jìn)行了深入的研究,為以后利用幾丁質(zhì)合成酶來防治銹赤扁谷盜提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。定蟲隆作為一種幾丁質(zhì)合成抑制劑被廣泛應(yīng)用,而定蟲隆對銹赤扁谷盜生長發(fā)育產(chǎn)生的影響,及可能的作用靶標(biāo)尚沒有系統(tǒng)性的研究。本研究以銹赤扁谷盜為對象,通過亞致死劑量的定蟲隆處理銹赤扁谷盜,研究定蟲隆對其生長發(fā)育的影響,及可能作用的靶標(biāo),為以后定蟲隆用于儲糧害蟲的防治提供理論基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:一、銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因的克隆根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序序列與其他昆蟲的CHS2基因進(jìn)行同源對比,找到保守區(qū)設(shè)計引物,擴(kuò)增了銹赤扁谷盜CHS2基因的3個片段,利用DNAMAN軟件拼接后獲得了銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因完整的開放閱讀框。將拼接得到的銹赤扁谷盜CHS2的基因序列翻譯成氨基酸,與赤擬谷盜等昆蟲的氨基酸進(jìn)行同源對比,構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果顯示銹赤扁谷盜的CHS2與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)、玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera)的CHS2蛋白親緣關(guān)系較近,命名該基因為CfCSH2(GenBank登陸號MH234580)。采用NCBI中的ORF Finder軟件分析表明,其開放閱讀框ORF包含4428bp,編碼1475個氨基酸。氨基酸序列沒有信號肽,有11個預(yù)測的糖基化位點,包含了14個跨膜結(jié)構(gòu),說明其編碼的蛋白是一個跨膜蛋白。其中的322(523-845)個氨基酸是幾丁質(zhì)合成酶的保守序列,含有幾丁質(zhì)合成酶特有的標(biāo)簽序列EDR和QRRRW。二、銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因的時空表達(dá)利用實時熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)對銹赤扁谷盜不同發(fā)育階段幾丁質(zhì)合成酶2(CfCHS2)基因的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,CfCSH2在銹赤扁谷盜卵、幼蟲、蛹和成蟲不同發(fā)育階段均有表達(dá),但表達(dá)量差異顯著(P0.05)。幼蟲階段CfCSH2在1齡的相對表達(dá)量最多,隨后逐漸減少,在蛹期表達(dá)量最低,卵期有少量表達(dá),成蟲期最多。說明了該基因在銹赤扁谷盜進(jìn)食期表達(dá)量較多,非進(jìn)食期表達(dá)量較少。CfCSH2在銹赤扁谷盜不同組織的表達(dá)量有顯著差異(P0.05)。在成蟲表皮中基本不表達(dá),在頭部、胸部、脂肪體中有少量的表達(dá),腹部的表達(dá)量最高,其次是中腸,腹部的高表達(dá)量可能與其樣品體積較大,包含組織較多有關(guān)。三、銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因的功能研究利用RNAi干擾技術(shù)研究了幾丁質(zhì)合成酶基因的功能及其對昆蟲生長發(fā)育的影響。分別用體外注射和飼喂的方法在銹赤扁谷盜幼蟲體內(nèi)實現(xiàn)了CfCHS2基因的沉默。結(jié)果表明:無論使用注射還是飼喂的方法,RNA沉默后幼蟲均出現(xiàn)軀體蜷縮,腹部干癟,無法正常爬行的現(xiàn)象。同時發(fā)現(xiàn)注射dsRNA的最佳干擾效率能達(dá)到64.83%,顯著高于飼喂組49.59%的干擾效率。持續(xù)飼喂7天后,實驗組的死亡率達(dá)到63.33%,顯著高于對照組的6.67%。在持續(xù)飼喂dsRNA的過程中發(fā)現(xiàn)CfCHS2出現(xiàn)過表達(dá)的現(xiàn)象,CfCHS2基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出先下降后上升再下降的現(xiàn)象,這說明在CfCHS2被dsRNA沉默后,昆蟲為了維持機(jī)體的穩(wěn)定,提高了機(jī)體CfCHS2的表達(dá)量,從而形成一種代償性增加的反饋機(jī)制。對RNAi處理后的銹赤扁谷盜的中腸進(jìn)行了甲苯胺藍(lán)染色和透射電鏡的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過沉默CfCHS2基因后的幼蟲中腸圍食膜缺失,腸道上皮細(xì)胞沒有圍食膜的保護(hù),不能附著在中腸橫肌,嚴(yán)重受損。這些結(jié)果說明幾丁質(zhì)合成酶2在銹赤扁谷盜中腸圍食膜的形成過程中發(fā)揮重要的作用。CfCHS2基因的沉默會使銹赤扁谷盜發(fā)育受阻,導(dǎo)致死亡。實驗選用納米殼聚糖作為傳遞載體,通過飼喂法使目的基因的表達(dá)量顯著下降,銹赤扁谷盜死亡率顯著升高,為以后基于RNAi技術(shù)防治銹赤扁谷盜提供了科學(xué)依據(jù)。四、定蟲隆對銹赤扁谷盜生長發(fā)育的影響及其作用機(jī)理研究建立了定蟲隆對銹赤扁谷盜作用的毒力方程:y=7.514+1.81x,r=0.974,計算得LD50為0.041 mg/kg,95%置信區(qū)間為0.025~0.059mg/kg;亞致死劑量LD_(10)、LD_(20)、LD_(30)分別為0.008mg/kg、0.014mg/kg、0.021mg/kg。另外研究發(fā)現(xiàn)亞致死劑量定蟲隆處理能夠顯著延長銹赤扁谷盜生長發(fā)育的歷期,體重顯著下降(P0.05)。經(jīng)定蟲隆LD_(30)長期處理的銹赤扁谷盜,體重可下降25%。低劑量的定蟲隆就可以導(dǎo)致銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)含量顯著下降(P0.05),說明定蟲隆對銹赤扁谷盜的生長發(fā)育具有顯著的抑制作用,可以用于儲糧害蟲銹赤扁谷盜的防治。實驗發(fā)現(xiàn)用LD_(30)定蟲隆處理銹赤扁谷盜三齡幼蟲CfCHS1基因的表達(dá)量明顯上調(diào),是對照組的1.787倍。CfCHS2基因的表達(dá)量也明顯上調(diào),是對照組的1.274倍。推測定蟲隆的作用靶標(biāo)是銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶,其抑制了CHS酶活性,使CHS不能正常的進(jìn)行幾丁質(zhì)的合成。
【圖文】：

蟲幾丁質(zhì)概述質(zhì)（chitin）又叫甲殼素，是自然中分布最廣泛、儲存量僅次于在昆蟲體內(nèi)，幾丁質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用形成昆蟲的表皮，，并且中腸圍食膜重要的結(jié)構(gòu)成分[24]，這些能使昆蟲在生長發(fā)育的過素對昆蟲的侵害[25]。昆蟲的生長與變態(tài)發(fā)育都依賴了幾丁質(zhì)結(jié)質(zhì)是由 N-乙�；�-D-葡糖胺通過β-1,4-糖普鍵連接而形成的高聚N)n，結(jié)構(gòu)圖見圖 1。它存在 3 種不同的晶體形態(tài):α-幾丁質(zhì)、β一種形態(tài)均具有不同的生物化學(xué)特征。α-幾丁質(zhì)剛性最強(qiáng)，在它主要存在于昆蟲外骨骼中以及幼蟲頭殼中。β-幾丁質(zhì)和 γ-幾于需要柔性的部位中，比如圍食膜[26-29]。昆蟲的蛻皮和生長發(fā)降解的調(diào)控[30]，因幾丁質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和植物纖維素十分相似，

河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文死亡。目前關(guān)于苯甲�；孱悮⑾x劑的作用機(jī)理仍不清楚，苯甲�；鍖τ紫x有顯的殺蟲效果，但對高齡期和成蟲期的害蟲毒性較小，速效性較差。
【學(xué)位授予單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S379.5

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本文編號：2621671