小黑楊（Populus simonii×Populus nigra）是楊柳科楊屬喬木,具有抗旱、耐寒、耐瘠薄等優(yōu)良性狀,是適合北方的造林樹(shù)種。ATX1（Anti-oxidant）是一種具有抗氧化功能的蛋白,在生物的銅穩(wěn)態(tài)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究利用小黑楊PnATXs基因構(gòu)建酵母表達(dá)載體,通過(guò)酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證了 PnATXs蛋白的抗氧化及銅伴侶功能。克隆小黑楊PnATXs基因的啟動(dòng)子,生物信息學(xué)分析證實(shí)小黑楊PnATXs啟動(dòng)子區(qū)域存在銅應(yīng)答元件CuRE,并通過(guò)GUS染色初步確定PnATX1和PnATX2全長(zhǎng)啟動(dòng)子具有生物學(xué)活性。構(gòu)建PnATX1基因的植物表達(dá)載體后遺傳轉(zhuǎn)化小黑楊,并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)以上試驗(yàn)得到的主要研究結(jié)果如下:（1）利用構(gòu)建的ATX基因的酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母突變體sod1△和atx1△。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化后的酵母sod1△細(xì)胞可以在有氧狀態(tài)下的SC-Lys培養(yǎng)基上生長(zhǎng),由此確定PnATXs蛋白具有抗氧化功能;酵母atx1△細(xì)胞在轉(zhuǎn)化后可以在含有鐵螯合劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),由此確定PnATXs蛋白具有銅伴侶蛋白功能。（2）利用毛果楊基因組序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR方... 

【文章來(lái)源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１葡萄銅穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因在銅脅迫條件下的表達(dá)??黑色代表表達(dá)量無(wú)變化，紅色代表表達(dá)量上調(diào)，白色代表表達(dá)量下調(diào)

核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以哥倫比亞野生型擬南芥ｃＤＮＡ為模板克隆基因，將擴(kuò)增??的基因連接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｈｍｔ克隆載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒，并進(jìn)行酵??母基因和擬南芥ＪＬ４７Ｘ／基因的ＰＣＲ鑒定，結(jié)果如圖２－１所示。??Ｍ?１?２?Ｍ?３?４??２０００ｂｐ?破＼??２５０ｂｐ??圖２－１酵母＊Ｓｃ４７Ｘ７基因和擬南芥／ＩＭｍ基因ｐＥＡＳＹ重組質(zhì)粒的ＰＣＲ結(jié)果??Ｍ：?ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；?１、２：?ｐＥＡＳＹ－ＳｃＺＴＸｉ；?３、４：?ｐＥＡＳＹｖ４ｔ４０７。??重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果表明，酵母Ｓｏ４７Ｘ？基因和擬南芥ＷＭ７Ｘ７基因克隆成功。以克??隆的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的基因片段，將擴(kuò)增片段和載體ｐＹＥＳ２同時(shí)酶切（如??圖２－２）、回收、連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并送測(cè)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后即成功構(gòu)建??重組載體ＰＹＥＳ２Ｕ７Ｘ／和ｐＹＥＳ２－ＪＭ７Ｘ／，重組載體ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果如圖２－３所示。??Ｍｌ?１?Ｍｌ?２?Ｍ２?３?４??２〇〇〇ｂｐ??２５０ｂｐ?｜?、－?＇?－?＾??圖２－２酵母Ｓｃ／ｉｒａ基因、擬南芥ｄｔ４７Ｘ７基因和ｐＹＥＳ２質(zhì)粒的酶切結(jié)果??Ｍｌ：?ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；?１：?酶切產(chǎn)物；２：?酶切產(chǎn)物；Ｍ２：?ＤＬ１５０００?ｍａｒｋｅｒ；?３：??ｐＹＥＳ２質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；４：?ｐＹＥＳ２質(zhì)粒。??－１６－??

核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以哥倫比亞野生型擬南芥ｃＤＮＡ為模板克隆基因，將擴(kuò)增??的基因連接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｈｍｔ克隆載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒，并進(jìn)行酵??母基因和擬南芥ＪＬ４７Ｘ／基因的ＰＣＲ鑒定，結(jié)果如圖２－１所示。??Ｍ?１?２?Ｍ?３?４??２０００ｂｐ?破＼??２５０ｂｐ??圖２－１酵母＊Ｓｃ４７Ｘ７基因和擬南芥／ＩＭｍ基因ｐＥＡＳＹ重組質(zhì)粒的ＰＣＲ結(jié)果??Ｍ：?ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；?１、２：?ｐＥＡＳＹ－ＳｃＺＴＸｉ；?３、４：?ｐＥＡＳＹｖ４ｔ４０７。??重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果表明，酵母Ｓｏ４７Ｘ？基因和擬南芥ＷＭ７Ｘ７基因克隆成功。以克??隆的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的基因片段，將擴(kuò)增片段和載體ｐＹＥＳ２同時(shí)酶切（如??圖２－２）、回收、連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并送測(cè)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后即成功構(gòu)建??重組載體ＰＹＥＳ２Ｕ７Ｘ／和ｐＹＥＳ２－ＪＭ７Ｘ／，重組載體ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果如圖２－３所示。??Ｍｌ?１?Ｍｌ?２?Ｍ２?３?４??２〇〇〇ｂｐ??２５０ｂｐ?｜?、－?＇?－?＾??圖２－２酵母Ｓｃ／ｉｒａ基因、擬南芥ｄｔ４７Ｘ７基因和ｐＹＥＳ２質(zhì)粒的酶切結(jié)果??Ｍｌ：?ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；?１：?酶切產(chǎn)物；２：?酶切產(chǎn)物；Ｍ２：?ＤＬ１５０００?ｍａｒｋｅｒ；?３：??ｐＹＥＳ２質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；４：?ｐＹＥＳ２質(zhì)粒。??－１６－??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3269305