青海云杉（Picea crassifolia Kom.）屬于松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）,是我國特有的常綠針葉喬木,是西北地區(qū)重要的造林和城市綠化樹種。本論文主要對甘肅省張掖龍渠青海云杉無性系種子園的125個無性系進(jìn)行了兩方面的研究:（1）青海云杉ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化,以及引物的篩選;（2）基于ISSRs的青海云杉無性系的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系的研究。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素分析方法,建立了青海云杉ISSR-PCR最適反應(yīng)體系。在20.0μL反應(yīng)體系中包含:模板DNA(5-10 ng·μL^-1)2.0μL、Mg²⁺(25 mmol·L^-1)2.8μL、10×PCR緩沖液2.8μL、引物(10μmol·L^-1)0.8μL、dNTPs(10 mmol·L^-1)0.3μL、Taq DNA聚合酶(5 U·μL^-1)0.2μL、HPLC超純水11.1μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;40個循環(huán):94℃變性45 s;49.5... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

青海云杉基因組DNAFig.3-1GenomicDNAofQinghaispruce

引物的退火溫度的高低影響擴(kuò)增條帶的清晰度。在 PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行 49.5℃-50.5℃溫度梯度實(shí)驗(yàn)。引物的退火溫度過低，擴(kuò)增的特異性條帶增多，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)判讀。引物的退火溫度過高，引物與模板 DNA 的結(jié)合會抑制，擴(kuò)增出的條帶會出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。青海云杉無性系 ISSR-PCR 試驗(yàn)中的最佳退火溫度為 49.5 ℃，擴(kuò)增出條帶清晰。在正交試驗(yàn)中中，反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件的分別優(yōu)化，得出最佳的青海云杉無性系的 ISSR-PCR 擴(kuò)增體系。青 海 云 杉 ISSR-PCR 最 適 反 應(yīng) 體 系 為 ： 模 板 DNA (5-10 ng μL-1) 2.0 μL 、dNTP (10 mmol L-1) 0.3 μL、引物 (10 μmol L-1) 0.8 μL、Mg2+(25 mmol L-1) 2.8 μL、 TaDNA 聚合酶 (5 U μL-1) 0.2 μL、10×PCR 緩沖液 2.8 μL、HPLC 超純水 11.1 μL，總體積為 20.0 μL。PCR 最終擴(kuò)增程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性4 min；40個循環(huán): 94 ℃變性45 s；49.5-50.5 ℃ 退火 45 s，72 ℃延伸 2 min；最后 72 ℃ 延伸 7 min，4 ℃保存。根據(jù)上述的最佳反應(yīng)體系將青海云杉無性系 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，再將產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳分離結(jié)果如下：

21Dice’s Similarity Coefficient圖 4-1 下圖 基于 ISSRs 和 Dice 相似性系數(shù)的青海云杉 125 個無性系聚類圖Fig. 4-1 Lower cluster of UPGMAdendrogram for 125 clones of Qinghai sprucebased on ISSRs and Dice’s similarity coefficient

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3227634