雌配子體(megagametophyte)是胚珠的核心結(jié)構(gòu),雌配子體游離核分裂期是胚珠發(fā)育過程中的關(guān)鍵時(shí)期。核分裂的失敗將阻礙雌配子體的成熟和卵細(xì)胞的產(chǎn)生,可導(dǎo)致植株雌性不育。所以,對該時(shí)期胚珠發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,具有重要的理論和實(shí)踐意義。目前,調(diào)控胚珠發(fā)育的分子機(jī)制已見報(bào)道,但主要圍繞被子植物展開,對裸子植物的相關(guān)研究較少。而裸子植物的胚珠發(fā)育與被子植物不同,特別是木本植物,其差異更加明顯。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)遼寧省興城油松(Pinus tabulaeformis Carr.)種子園內(nèi)的油松28號(hào)雌性不育系胚珠敗育,主要原因是雌配子體游離核中途停止分裂,并認(rèn)為這一雌性不育現(xiàn)象是多種基因共同調(diào)控表達(dá)的結(jié)果。蛋白質(zhì)是功能基因綜合表達(dá)的產(chǎn)物,更能直接體現(xiàn)植物生長發(fā)育的調(diào)控特點(diǎn)。因此,本論文采用雙向電泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)及相對和絕對定量的等量異位標(biāo)簽(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),輔以形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和分子生物學(xué)等研究手段,對油松可育系(fertile line,FL)和不育系(sterile line,SL)雌配子體游離核有絲分裂期的胚珠差異表達(dá)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究,以揭示28號(hào)不育系雌配子體游離核有絲分裂中途停止的分子調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.對油松大孢子葉球發(fā)生發(fā)育過程中的形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)觀察,準(zhǔn)確掌握了胚珠發(fā)育的階段,得到主要結(jié)果如下:在第1年秋季,當(dāng)油松新芽縱徑(longitudinal diameter,LD)約為7.0 mm時(shí),腋芽原基發(fā)育,入冬后花芽休眠。至第2年春季初生大孢子葉球LD(ovulate strobilus LD,LDOs)約為5.0 mm時(shí),胚珠細(xì)胞分化。在LDOs約為6.0 mm時(shí),大孢子母細(xì)胞分化;約為11.0 mm時(shí),胚珠中存在數(shù)十個(gè)游離核;之后,胚珠越冬休眠。到第3年春季,LDOs約為21.0mm,游離核數(shù)目達(dá)幾千個(gè);當(dāng)雌配子體開始形成細(xì)胞壁時(shí),LDOs約為31.0 mm。在LDOs約為37.0 mm時(shí),頸卵器原始細(xì)胞分化;約為43.0 mm時(shí),頸卵器、卵細(xì)胞發(fā)育成熟,雌配子體細(xì)胞化完成;約為45.0 mm時(shí),受精作用發(fā)生。至秋季LDOs約為53.0 mm時(shí),球果內(nèi)即可觀察到成熟胚。油松大孢子葉球的發(fā)生發(fā)育過程共歷時(shí)26個(gè)月,跨越3年。2.對處于雌配子體游離核旺盛分裂期的油松兩系胚珠蛋白質(zhì)組進(jìn)行了基于2-DE技術(shù)的分離分析。最終在FL和SL胚珠中分別分離到蛋白質(zhì)1424個(gè)和1224個(gè)。有42個(gè)蛋白質(zhì)在兩系胚珠中差異表達(dá)(ratio1.5)。其中,SL胚珠與FL相比有9個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量下降,33個(gè)上升。質(zhì)譜分析成功鑒定了 9個(gè)蛋白,它們是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、鈣調(diào)素、ATP合酶β亞基、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、依賴于DNA的RNA聚合酶B、泛酸激酶、熱激同源蛋白70-1以及兩個(gè)未知蛋白。它們與物質(zhì)和能量代謝、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及脅迫抵抗相關(guān),暗示SL油松胚珠中物質(zhì)和能量代謝異常、可能遭受脅迫。3.對處于雌配子體游離核分裂前、后期的油松兩系胚珠蛋白質(zhì)組進(jìn)行了基于iTRAQ技術(shù)的分離分析。最終鑒定到蛋白質(zhì)4192個(gè),四組有效比對中各包含差異表達(dá)蛋白質(zhì)400多個(gè)(ratio1.2)。質(zhì)譜定性和生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,有至少37個(gè)差異蛋白參與油松胚珠發(fā)育的調(diào)控,包括肉桂酰輔酶A還原酶、過氧化物酶前體、電子傳遞黃素蛋白:泛醌氧化還原酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶、DNA依賴蛋白激酶催化亞單位、類鈣調(diào)磷酸酶B亞基、DNA復(fù)制蛋白A、甘油-3-磷酸�；D(zhuǎn)移酶6等。它們在油松兩系胚珠中的差異表達(dá)情況表明:在SL油松雌配子體游離核有絲分裂期,(1)胚珠內(nèi)的物質(zhì)供給短缺和能量代謝異常共同導(dǎo)致了蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制發(fā)生異常。(2)在肝珠遭受氧化脅迫時(shí),與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)不能抑制乙烯的生成,也不能削弱H202造成的脅迫傷害。所以,不斷積累的H202和過高含量的乙烯,破壞了質(zhì)膜的半透性,影響了 Ca2+的濃度和蛋白質(zhì)的磷酸化,損傷了生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致了 DNA雙鏈斷裂(Double-Strand Breaks,DSBs)的發(fā)生。(3)當(dāng)DNA復(fù)制異常及損傷時(shí),肝珠中細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)失敗。所以,SL肝珠細(xì)胞最終開啟了細(xì)胞程序化死亡進(jìn)程,導(dǎo)致雌配子體游離核有絲分裂失敗。4.通過熒光反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),研究了 DNA依賴蛋白激酶催化亞單位、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶、DNA復(fù)制蛋白A等10個(gè)差異蛋白在油松雌配子體游離核有絲分裂期胚珠mRNA的表達(dá)規(guī)律,驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果。
【學(xué)位單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S791.254
【部分圖文】：

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??ｍｍ．??圖２－１油松花芽??Ｆｉｇ．２－１?Ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ??注：圖板所示為第１年７月２０日（Ａ）、８月２０日（Ｂ）、９月２０日（Ｃ）、１０月２０日（Ｄ）、１１??月?２０?日（Ｅ）和?１２?月?２０?日（Ｆ）的油松花芽。（Ｔｈｅ?ｐｌａｔｅ?ｓｈｏｗｅｄ?ｔｈｅ?ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄｓ?ｏｆ／！如如／＜３響ｒｍｚｉ??ｉｎ?Ｊｕｌｙ?２０?（Ａ），?Ａｕｇｕｓｔ?２０?（Ｂ），?Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ?２０?（Ｃ），?Ｏｃｔｏｂｅｒ?２０?（Ｄ），?Ｎｏｖｅｍｂｅｒ?２０?（Ｅ）?ａｎｄ?Ｄｅｃｅｍｂｅｒ?２０??（Ｆ）?ｏｆ?ｔｈｅ?ｆｉｒｓｔ?ｙｅａｒ．）??ＢＫ１Ｉ??圖２－２油松花芽??Ｆｉｇ．２－２?Ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ??注：圖板所示為第２年１月２０日（Ａ）、２月２０日（Ｂ）、３月１０日（Ｃ）、３月２０日（Ｄ）、３月??３０日（Ｅ）和４月１０日（Ｆ）的油松花芽。圖Ｆ中箭頭所示為小孢子葉球。（Ｔｈｅ?ｐｌａｔｅ?ｓｈｏｗｅｄ?ｔｈｅ??ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ?ｉｎ?Ｊａｎｕａｒｙ?２０?（Ａ），?Ｆｅｂｒｕａｒｙ?２０?（Ｂ）．?Ｍａｒｃｈ?１０?（Ｃ），?Ｍａｒｃｈ?２０?（Ｄ），??１０??

?（４）從第２年５月中旬開始，球果緩慢長大，珠鱗的顏色由紅轉(zhuǎn)綠后變?yōu)樽厣??（圖２－４?Ａ？Ｊ）。此后，球果生長緩慢，冬季休眠（圖２－５?Ａ？Ｊ）。??卜—ｊ??＿藝酵??們｜丨驛；ｍ??■ｆｔ?｜０＞５ｍｌｍ?５．〇ｍｍ?■?０．?Ｓｆｒｉｉｍ?５〇ｍ—?ｐ?５ｍｉｍ?５０?ｍｍ??Ｊ??４０＊０?「??————一——————￣———一．．．．．．??３５．０?－?????????—－?????ｊ?２５．０????２０．０?＾?－?――—．．．???－．一——－…．…．．?．????＿?１５．０?．．－．．．？．．———————ａ——？．…ａ?ａ?ａ?ａ?ａ．……．??Ｉ?三?ｆｅｍｊｊｊｊｊ??５－１０?５－２０?５－３０?６－１０?６－２０?６－３０?７－１０?７－２０?７－３０??曰期??圖２－４油松球果??Ｆｉｇ．２－４?Ｃｏｎｅｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ??注：圖板所示為第２年５月１０日（Ａ）、５月２０日（Ｂ）、５月３０日（Ｃ）、６月１０日（Ｄ）、６月??２０日（Ｅ）、６月３０日（Ｆ）、７月１０日（Ｇ）、７月２０日（Ｈ）和７月３０日⑴的油松球果。圖??Ｊ為球果縱徑柱狀圖，數(shù)值由３次生物學(xué)重復(fù)獲得，表示為平均值：ｔＳＥ，小寫字母表示多重比較??分析結(jié)果（Ｐ?＜?０．０５）。（Ｔｈｅ?ｐｌａｔｅ?ｓｈｏｗｅｄ?ｔｈｅ?ｃｏｎｅｓ?ｏｆ?Ｐ．?／Ｍｗ／ａ吻，７？治?ｉｎ?Ｍａｙ?１０?（Ａ），?Ｍａｙ?２０?（Ｂ），Ｍａｙ??３０?（Ｃ）

本文編號(hào)：2841726