為建立高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)木質(zhì)部特異啟動(dòng)子JCes AP系列缺失片段的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),本試驗(yàn)以煙草和三倍體毛白楊無菌苗為試驗(yàn)材料,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將前期構(gòu)建的融合楊樹木質(zhì)部特異啟動(dòng)子缺失片段的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草和楊樹。對獲得的抗性植株進(jìn)行PCR檢測和報(bào)告基因活性分析,從而檢測轉(zhuǎn)化效果。主要結(jié)果如下:(1)在煙草遺傳轉(zhuǎn)化過程中,確立了適宜的菌液濃度為OD600≈0.4~0.6,一般侵染時(shí)間為8~10min,共培養(yǎng)2d為宜。最佳分化培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA,頭孢噻肟鈉的抑菌濃度為50mg/L,卡那霉素生根篩選過程中的適宜濃度為20mg/L,潮霉素生根篩選濃度為5mg/L。(2)采用注射法進(jìn)行煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化,對煙草葉片進(jìn)行GUS染色(p BI121)和GFP綠色熒光檢測(p CAMBIA1302),結(jié)果表明攜帶不同缺失片段與GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植物在不同部位均可以觀察到藍(lán)色;攜帶不同缺失片段與GFP報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植物在不同部位均可以觀察到綠色熒光。說明啟動(dòng)子系列缺失片段均具有啟動(dòng)子活性。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法,將融合啟動(dòng)子缺失片段的p BI121和p CAMBIA1302植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草。經(jīng)過PCR檢測和報(bào)告基因活性檢測分析,結(jié)果表明不同目的基因已經(jīng)整合到了煙草基因組中,獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株共24株,轉(zhuǎn)化率達(dá)27%。(3)在毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化過程中確定了菌液最佳侵染時(shí)間為3min,最適合的菌液濃度為OD600≈0.4,建立了最佳分化培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,在篩選和生根過程中頭孢噻肟鈉的抑菌濃度為50mg/L,卡那霉素的適宜濃度為20mg/L。(4)采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法對楊樹葉片進(jìn)行GUS染色,結(jié)果表明攜帶不同缺失片段的與GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植物在相應(yīng)部位均可以觀察到藍(lán)色,說明啟動(dòng)子系列缺失片段均具有啟動(dòng)子活性。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法,將融合啟動(dòng)子缺失片段的p BI121植物表達(dá)載體對楊樹進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過PCR分子檢測和GUS染色,結(jié)果表明ZU2、ZU3、ZU4、L2缺失片段已轉(zhuǎn)入楊樹,L3、L4基因獲得的植株為假陽性植株,未轉(zhuǎn)化到楊樹中。共獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株17株,轉(zhuǎn)化率達(dá)53%。
【學(xué)位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S792.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2822732