【摘要】：毛白楊(Populus tomentosa)是我國(guó)特有的白楊派鄉(xiāng)土樹(shù)種,主要分布于黃河流域、淮河流域的10個(gè)省份,在林業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)保護(hù)和城鄉(xiāng)綠化占有重要地位。實(shí)踐中楊樹(shù)彩葉品種較少,不能滿足生態(tài)文明建設(shè)中“延綠增彩”的需求及市場(chǎng)對(duì)品種多樣化的趨勢(shì)。因此,開(kāi)展毛白楊花青素合成途徑關(guān)鍵基因的克隆及其特性研究,并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定,對(duì)于闡明楊樹(shù)葉色變異的分子機(jī)制具有重要的理論意義,同時(shí)可為基因工程改良創(chuàng)制新的楊樹(shù)彩葉新品種提供有價(jià)值的候選基因。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過(guò)PCR方法克隆獲得毛白楊PtDFR基因,采用生物信息軟件進(jìn)行了一系列特性分析,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析揭示該基因的表達(dá)模式。采用基因編輯技術(shù)--CRISPR/Cas9對(duì)楊樹(shù)MYB183進(jìn)行了初步研究。為后續(xù)對(duì)毛白楊的遺傳改良及進(jìn)一步解析毛白楊花青素合成途徑相關(guān)基因的功能奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下(1)根據(jù)毛白楊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)DFR基因PCR引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了毛白楊DFR基因家族的1個(gè)成員,命名為PtDFR。測(cè)序結(jié)果表明,該基因序列全長(zhǎng)為1,59lbp,包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,CDS長(zhǎng)度為954bp,編碼317個(gè)氨基酸,具有1個(gè)NADP(H)保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)底物特異性結(jié)合位點(diǎn)。理化性質(zhì)和功能域分析表明,基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為38.06 kD,理論等電點(diǎn)為5.62,翻譯后的蛋白質(zhì)不是分泌蛋白且為親水性蛋白,具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列相似性分析,毛白楊與銀白楊、毛果楊DFR氨基酸相似性高達(dá)95.65%和94.21%,而與柑橘、棗、葡萄等7個(gè)物種DFR氨基酸相似性達(dá)到89.29%～82.14%。進(jìn)化分析表明,毛白楊與毛果楊、銀白楊遺傳距離最近聚為一組,與單子葉植物小麥、水稻距離較遠(yuǎn)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,PtDFR在不同組織器官中的表達(dá)量存在明顯差異,在萌動(dòng)營(yíng)養(yǎng)芽表達(dá)量最高,休眠營(yíng)養(yǎng)芽最低,在不同時(shí)期雌雄花芽表達(dá)趨勢(shì)相似。(2)利用CRISPR/Cas9技術(shù),依據(jù)毛果楊MYB183設(shè)計(jì)構(gòu)建了 6個(gè)單sgRN A靶點(diǎn)載體,并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在毛白楊中進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。通過(guò)PCR篩選得到部分陽(yáng)性株系,經(jīng)測(cè)序分析對(duì)比野生型與陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn),6號(hào)靶點(diǎn)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了堿基的改變,進(jìn)一步進(jìn)行氨基酸比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系S9、S37與野生型株系氨基酸序列沒(méi)有發(fā)生變化,其原因可能同義突變或由于等位基因間序列存在差異導(dǎo)致編碼氨基酸沒(méi)有發(fā)生變化。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S792.117
【圖文】：

Ａ：邋ＤＦＲ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ；邋Ｂ：邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＤＦＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｔｏｍｅｎｔｏｓａ＼逡逑Ｃ：邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＰｔＤＦＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑圖３－５毛白楊ＤＦＲ的信號(hào)肽、親水性／疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域逡逑Ｆｉｇ．３－５邋Ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ，邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ邋ａｎｄ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＤＦＲ邋ｏｆ逡逑Ｐ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ逡逑３．２．５毛白楊編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)逡逑利用ＳＯＰＭＡ在線分析軟件對(duì)ＤＦＲ蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果（如圖３－６）逡逑顯示

逡逑圖５－２轉(zhuǎn)基因苗ＰＣＲ檢測(cè)圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋５－２邋ＰＣＲ邋ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｐｌａｎｔｌｅｔｓ逡逑將上述篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系利用靶點(diǎn)兩端側(cè)翼序列特異引物進(jìn)行ＰＣＲ逡逑反應(yīng)，獲得的產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后送至公司進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步的分析確定靶目標(biāo)逡逑位點(diǎn)序列是否發(fā)生變化。將野生型與陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗測(cè)序結(jié)果比對(duì)之后發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)逡逑為ｓｇＲＮＡ６（圖５－２）的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗發(fā)生了序列的變化，其中Ｓ９號(hào)株系（圖５－３）逡逑發(fā)生了多堿基的轉(zhuǎn)換，原本為ＴＴ堿基變?yōu)椋茫翂A基，ＣＡＧ堿基變?yōu)椋牵茫詨A基，Ｔ逡逑堿基變?yōu)椋翂A基；Ｓ３７號(hào)株系由ＴＴ堿基變?yōu)椋茫翂A基，ＧＴ堿基變?yōu)椋粒翂A基。逡逑利用ＤＮＡＭＡＮ軟件進(jìn)行氨基酸比對(duì)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系Ｓ９、Ｓ３７與野生型株系氨逡逑基酸序列沒(méi)有發(fā)生變化，這可能是由于氨基酸有多個(gè)對(duì)應(yīng)的密碼子，屬于同義密逡逑碼子

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本文編號(hào)：2720657