【摘要】：由橡膠粉孢(Oidium heveae B A. Steinmann,O. heveae)侵染導致的白粉菌是我國橡膠樹的最重要病害,其導致嚴重的干膠產(chǎn)量損失。O. eveae為專性寄生菌,不能直接進行遺傳轉化操作,故而其致病分子生物學研究基礎迄今比較薄弱,可利用的資料很少。Hog1信號途徑在真菌細胞中廣泛存在。該途徑是生物體適應高滲逆境所必需的,也可能與O.heveae適應寄主環(huán)境有關。本研究從篩選獲得的13個Hog1信號途徑相關基因中,選取有代表性的OhPbs2和OhCdc42基因,通過同源克隆和原生質體轉化等技術,分別借助橡膠樹炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides,C.gloeosporioides)和稻瘟菌(Magnaporthe grisea,M.grisea)鑒定這兩個基因的功能,為闡明O.heveae對橡膠樹的致病分子機理提供基礎資料。主要研究結果如下:1.克隆到13個與Hog1途徑相關的基因。在O. heveae基因組測序基礎上,通過NCBI比對,采用同源克隆的方法,用Primer 5.0設計引物后克隆,得到13個Hog1途徑相關基因,分別命名為:OhHog1、OhPbs2、OhSte11、OhSte50、OhSte20、OhCla4、OhBem1、OhCdc42、OhOpy2、OhYpd1、OhSsk1、OhSsk2/22、OhSho1。2.預測和驗證了OhPbs 基因的功能。利用生物信息學分析方法進行氨基酸序列比對并構建系統(tǒng)進化樹,預測OhPbs2基因編碼蛋白為Pbs2,其功能與菌絲生長、細胞壁完整性、氧化壓力傳導和高滲透壓甘油合成等生理生化過程有關。通過同源重組和原生質體轉化技術將O.heveae 的OhPbs2基因轉化到C.gloeosporioides的Pbs2基因缺失突變體△CgPbs2的基因組中,獲得互補轉化子△CgPbs2+OhPbs2。表型比對結果表明:△CgPbs2不能在高滲透壓的培養(yǎng)基(1.5M山梨醇的PDA平板)環(huán)境下生長,而△CgPbs2+OhPbs2則能正常生長,表明適應高滲透壓環(huán)境確實是OhPbs2基因的功能之一;在常規(guī)培養(yǎng)基、較高濃度的H2O2、較高濃度的SDS (十二烷基硫酸鈉)以及殺菌劑咯菌腈的環(huán)境中,△CgPbs2+OhPbs2的生長發(fā)育表現(xiàn)均與C. gloeosporioides和△CgPbs2有明顯差別,表明OhPbs2基因具有調控C. gloeosporioides生長發(fā)育、對氧化應激的反應、菌絲細胞壁發(fā)育、抵抗殺菌劑逆境等功能;對橡膠樹葉片的致病力測定結果表明:C.gloeosporioides、△CgPbs2和△CgPbs2+OhPbs2均能誘發(fā)葉片出現(xiàn)典型炭疽病病狀,但 C. gloeosporioides 比△CgPbs2 和△CgPbs2+ OhPbs2 誘發(fā)更重的病害,而△CgPbs2與△CgPbs2+OhPbs2的病害嚴重程度無顯著差別,表明OhPbs2對C. gloeosporioides致病力的正調控能力不如CgPbs2。3.預測和驗證了OhCdc4 基因的功能。利用生物信息學分析方法進行氨基酸序列比對并構建系統(tǒng)進化樹,預測OhCdc42基因編碼的是與稻瘟菌類似的Cdc42蛋白,功能與MAPK信號途徑有關。利用同源重組和原生質體轉化技術,將OhCdc42轉化到缺失Cdc42的M. grisea突變體△MgCdc42中,獲得互補轉化子△MgCdc42+OhCdc42。表型比對結果表明:在常規(guī)培養(yǎng)基、高滲透壓以及較高濃度的H2O2等環(huán)境下,△MgCdc42+OhCdc42能長出基本正常的菌落,而Mgrisea突變體△MgCdc42則只能長出微弱的菌落,且前者的菌落大小顯著大于后者,表明OhCdc42基因參與調控病原菌菌落顏色,且與病菌的滲透壓力和氧化壓力傳導、抵抗殺菌劑逆境等有關;在較高濃度的SDS的環(huán)境中,△MgCdc42+OhCdc42的生長發(fā)育表現(xiàn)均與M.grisea和△MgCdc42沒有明顯差異,但也能夠部分恢復稻瘟菌耐受SDS的能力。對水稻葉片的致病力測定結果顯示:M.grisea、△MgCdc42和△MgCdc42+OhCdc42均能誘發(fā)水稻品種C039產(chǎn)生典型的稻瘟病病斑,△MgCdc42+OhCdc42誘發(fā)的病害嚴重程度與M.grisea無差別,但兩者均顯著高于△MgCdc42誘發(fā)的病害,據(jù)此推斷,OhCdc42基因在病原-寄主互作關系中,由于在信號傳導途徑中發(fā)揮作用而正調控了病原菌的致病力。4.分析比對了來自不同地點O.heveae的OhPbs2和OhCdc42基因。分別從海南3個橡膠樹種植地點收集O.heveae,提取DNA,克隆OhPbs2和OhCdc42基因并測序,對序列信息進行生物信息和進化表達分析。結果表明:來自不同地點的OhPbs2和OhCdc42基因,在保守區(qū)域不存在明顯差異。
【圖文】：

并通過一系列信號途徑將信號最終傳遞給轉錄因子，激活效應蛋白表達并產(chǎn)生相應答反應（Ｋｕｍａｍｏｔｏ，２００８）。逡逑在真核生物體內(nèi)存在著許多既彼此獨立又相互協(xié)作的復雜信號網(wǎng)絡，保證生能夠感受到外界環(huán)境中的變化同時迅速得做出正確的應答反應（Ｊｕｎｔｔｉｌａｅｔａｌ．，２００８）在這復雜的信號網(wǎng)絡中，有一些普遍存在于生物體內(nèi)且十分保守的信號途徑。其ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ邋ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅｓ）信號途徑主要是通過絲／蘇氨酸蛋白激酶的酸化來調節(jié)生物體內(nèi)復雜的生理功能。ＭＡＰＫ信號途徑是由ＭＡＰＫＫＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｋｉｎａｓｅ邋ｋｉｎａｓｅ）、ＭＡＰＫＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｓｅ邋ｋｉｎａｓｅ）和邋ＭＡＰＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｓｅ）組成的級聯(lián)激酶號途徑，ＭＡＰＫＫＫ－ＭＡＰＫＫ－ＭＡＰＫ是依次被激活的（Ｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。激活的ＭＡＰ進一步激活下游的轉錄因子以及其它效應蛋白，最終生物體對外界特定的環(huán)境信號出正確的應答反應。ＭＡＰＫ信號途徑之間也是既彼此獨立又相互協(xié)作的。在植物原真菌中，ＭＡＰＫ信號通路參與了有性生殖、環(huán)境脅迫應答、維持細胞壁完整性致病力等方面的調控（Ｈａｍｅｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２）。逡逑ＰｈｅｒｏＴ＾ｏｎｅｓ邐Ｎｕｔ＂？ｅｎｔ邐Ｈｉｇｈ邋ｏｓｎｏ邋ａｒｉｔｙ邐Ｃｅｌｌ邋ｗａｉｌ邋ｓｔｒｅｓｓ逡逑

孫雅琦將橡膠樹白粉菌基因組數(shù)據(jù)庫和小麥白粉菌ＱＢｌｔｍｅｒｉａｇｍｍＭｓ）同源序逡逑列比對，獲得２５個ＭＡＰＫ信號途徑相關基因。利用蛋白質結構域及聚類分析構建橡逡逑膠樹白粉菌中的ＭＡＰＫ級聯(lián)途徑簡圖（圖３），Ｆｕｓ３ａｎｄＫｓｓｌＭＡＰＫ信號途徑有５逡逑個基因，Ｈｏｇｌ邋ＭＡＰＫ信號途徑有５個基因，其中Ｓｔｅ邋１１、Ｓｔｅ邋５０、Ｃｄｃ邋４２在兩條途徑逡逑中都起作用，屬于功能冗余現(xiàn)象。Ｓｔｉｌ（Ｍｐｋｌ）ＭＡＰＫ信號途徑有６個基因，胞外激逡逑發(fā)ＭＡＰＫ反應有５個基因（孫雅琦等，，２０１５）。逡逑通過實時熒光定量分析，了解ＭＡＰＫ相關基因在侵染階段的表達差異情況。結逡逑合橡膠樹白粉菌在ｐａｒａｆｉｌｍ表面培養(yǎng)０－２４ｈｐｉ（ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）的侵染發(fā)育可大致逡逑歸納為未萌發(fā)（Ｏｈｐｉ）、萌發(fā)（４ｈｐｉ）、附著胞形成（６、８ｈｐｉ）和次生附著胞（１６、逡逑２４ｈｐｉ）等４個形態(tài)發(fā)育階段，研宄發(fā)現(xiàn)ＭＡＰＫ途徑的Ｆｕｓ３邋ａｎｄＫｓｓｌ邋ｐａｔｈｗａｙ在芽管逡逑生成時發(fā)揮主要作用；Ｍｅｋｌ、Ｂｋｋｌ、和奶Ｍ在附著胞形成過程中起主要作用；逡逑在吸器和菌絲形成時，ＭＡＰＫ途徑中的Ｈｏｇｌ邋ＭＡＰＫ邋ｐａｔｈｗａｙ起主要作用（孫雅琦，逡逑２０１５）。逡逑用ＭＡＰＫ信號途徑特異性外源抑制劑－Ｕ０１２６處理，促使橡膠樹白粉菌在非誘導逡逑瓊脂表面萌發(fā)并形成附著胞。研宄發(fā)現(xiàn)ＭＡＰＫ途徑相關基因參與了邋Ｏ．邋ｈｅｖｅａｅ的萌發(fā)逡逑過程（孫雅琦
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S763.7

【參考文獻】

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3 萬三連;梁鵬;宋風雅;張宇;劉文波;繆衛(wèi)國;鄭服叢;;橡膠樹白粉病菌分生孢子在不同介質的萌發(fā)過程及其內(nèi)容物的變化[J];植物病理學報;2014年06期

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6 鞏校東;張曉玉;田蘭;王星懿;李坡;張盼;王s

本文編號：2660944