棉大卷葉螟(Sylepta derogataFabricius)是鱗翅目螟蛾科昆蟲,分布范圍廣、寄主種類多,能對多種經(jīng)濟作物產(chǎn)生較大危害。為了進一步研究棉大卷葉螟的吐絲危害機理,本文以棉大卷葉螟的絲素重鏈基因為研究對象,克隆得到其cDNA全長序列,測定了不同發(fā)育階段棉大卷葉螟吐絲基因的表達量,以及取食不同寄主后棉大卷葉螟吐絲基因的表達量。在此基礎(chǔ)上,運用飼喂法干擾棉大卷葉螟絲素重基因的表達,進而影響卷葉螟的吐絲卷葉,并觀察干擾表達后對棉大卷葉螟種群發(fā)育與蛹重的影響。結(jié)果如下:1.根據(jù)文獻報導(dǎo)的其他昆蟲的絲素重鏈基因,通過RACE法克隆得到棉大卷葉螟絲素重鏈基因cDNA全長。棉大卷葉螟絲素重鏈基因cDNA全長為1465bp,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAG,開放閱讀框全長為1323bp。依據(jù)棉大卷葉螟絲素重鏈基因的核苷酸序列推導(dǎo)其氨基酸序列,估算該蛋白分子量為43.553kDa,等電點pI為6.26。將所獲得的基因全長同其他已經(jīng)登錄到GenBank的昆蟲絲素重鏈基因序列進行比對,發(fā)現(xiàn)與棉大卷葉螟絲素重鏈基因序列一致性最高的是外米綴蛾(Corcyra cephalonica),達到65...

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【學(xué)位級別】：碩士

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摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 棉大卷葉螟生物學(xué)習(xí)性與危害
        1.1.1 棉大卷葉螟生物學(xué)習(xí)性
        1.1.2 影響棉大卷葉螟種群數(shù)量的一些因素
        1.1.3 防治對策
    1.2 昆蟲吐絲概況
        1.2.1 絲對昆蟲的作用
        1.2.2 絲對人類的作用
        1.2.3 絲的研究進展
    1.3 RNA干擾
        1.3.1 RNAi的研究概況
        1.3.2 siRNA在昆蟲上的應(yīng)用
        1.3.3 應(yīng)用RNAi對昆蟲的研究
    1.4 研究目的和意義
第二章 棉大卷葉螟絲素重鏈基因的克隆
    2.1 供試材料
        2.1.1 棉大卷葉螟蟲源
        2.1.2 試驗試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 總RNA的提取
    2.3 cDNA第一鏈合成
    2.4 棉大卷葉螟絲素重鏈基因中間片段的擴增
        2.4.1 引物設(shè)計與合成
        2.4.2 絲素重鏈基因中間片段的擴增
        2.4.3 目的基因片段產(chǎn)物的回收與純化
        2.4.4 目的基因產(chǎn)物的連接
        2.4.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.4.6 單菌落PCR檢測
        2.4.7 測序
        2.4.8 序列分析
    2.5 絲素重鏈基因的3'Race
        2.5.1 引物設(shè)計
        2.5.2 3'RACE的擴增
    2.6 絲素重鏈基因的5'Race
        2.6.1 引物設(shè)計
        2.6.2 棉大卷葉螟總RNA中裸露的5'磷酸基團的去除
        2.6.3 mRNA 5'帽子結(jié)構(gòu)的去除
        2.6.5 反轉(zhuǎn)錄
        2.6.6 PCR擴增
    2.7 序列分析
    2.8 結(jié)果與分析
        2.8.1 絲素重鏈基因中間片段擴增結(jié)果
        2.8.2 3'RACE擴增結(jié)果
        2.8.3 5'RACE擴增結(jié)果
        2.8.4 開放閱讀框擴增結(jié)果
        2.8.5 序列分析
    2.9 小結(jié)與討論
第三章 棉大卷葉螟絲素重鏈鏈基因在不同發(fā)育階段以及飼喂不同寄主后的表達分析
    3.1 供試材料
        3.1.1 棉大卷葉螟蟲源
        3.1.2 試驗試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 試驗方法
        3.2.1 不同發(fā)育階段處理
        3.2.2 不同寄主處理
        3.2.3 不同處理樣品的RNA提取
        3.2.4 反轉(zhuǎn)錄
        3.2.5 引物設(shè)計與合成
        3.2.6 重鏈基因?qū)崟r定量分析
        3.2.7 數(shù)據(jù)處理
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 引物與內(nèi)參基因的可靠性
        3.3.2 棉大卷葉螟不同發(fā)育階段絲素重鏈基因的相對表達量
        3.3.3 棉大卷葉螟飼喂不同寄主后絲素重鏈基因的相對表達量
    3.4 小結(jié)與討論
第四章 棉大卷葉螟絲素重鏈基因的RNA干擾
    4.1 供試材料
        4.1.1 棉大卷葉螟蟲源
        4.1.2 試驗試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 dsRNA表達載體的構(gòu)建
        4.2.1 引物的設(shè)計與合成
        4.2.2 目標基因片段的制備
        4.2.3 連接與轉(zhuǎn)化
        4.2.4 提取質(zhì)粒
        4.2.5 酶切
        4.2.6 連接
        4.2.7 轉(zhuǎn)化至HT115大腸桿菌
        4.2.8 dsRNA在大腸桿菌中的表達
        4.2.9 dsRNA檢驗
        4.2.10 喂食表達dsRNA細菌液的試驗方法
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 dsRNA在大腸桿菌中的表達
        4.3.2 飼喂菌液對棉大卷葉螟幼蟲的影響
        4.3.3 棉大卷葉螟幼蟲喂食不同濃度菌液后絲素重鏈基因相對表達量變化.
        4.3.4 不同蟲齡棉大卷葉螟幼蟲喂食菌液不同天數(shù)后絲素重鏈基因的相對表達量
        4.3.5 喂食棉大卷葉螟幼蟲菌液對卷葉螟生長發(fā)育的影響
    4.4 小結(jié)與討論
第五章 全文總結(jié)與展望
參考文獻
致謝



本文編號：4046453